Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı
Summary
Canlı hücreler içinde ubiquitin-proteasome etkinliğini izlemek için bir yöntem tarif edilmektedir. A degron-İstikrarsızlaşmış GFP-(GFP-DGN) ve bir sabit GFP-dgnFS füzyon proteini oluşturulur ve bir lentiviral ifade vektörü kullanılarak hücre içine transdüksiyon ile uygulanır. Bu teknik, ubiquitin-proteasome etkinlik kolaylıkla Epifloresans ya da akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir hangi bir sabit GFP-dgn/GFP-dgnFS eksprese eden hücre soyu üretmek için olanak sağlar.
Abstract
Proteazom anormal, katlanan hasar görmüş ya da oksitlenmiş proteinler 1, 2, proteolitik bozulması ile ilgili ana hücre içi organel olup. Proteazom faaliyet Bakım hücrenin stres yanıtı 3, hücre döngüsü kontrolü ve hücresel farklılaşma 4 veya bağışıklık sistemi yanıtı 5, gibi birçok temel hücresel süreçler karışmıştı. Ubiquitin-proteasome sistemi fonksiyon bozukluğu tümörler ve nörodejeneratif hastalıklar, 4, 6 ve gelişimi ile ilgili olmuştur. Buna ek olarak, proteazom aktivitesinde bir azalma hücresel yaşlanma ve organizma yaşlanma 7, 8, 9, 10 bir özellik olarak tespit edildi. Burada, bir GFP-DGN füzyon proteini kullanarak canlı hücrelerde ubikuitin-proteazom aktivitesini ölçmek için bir yöntem mevcut. Birincil hücreler canlı ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek edebilmek için, tamamlayıcı DNA (yeşil floresan protein (GFP)-DGN füzyon proteini kodlayan inşa GFP-DGN, kararsız) ve bir çerçeve kayması mutasyon (GFP-dgnFS, kararlı 11) taşıyan bir varyant lentiviral ekspresyon vektörleri içine yerleştirilir. Bu hücre tipi ya da donör yaşı bağımsız çok yüksek transfeksiyon verimliliği garanti çünkü geleneksel transfeksiyon teknikleri üzerinde bu tekniği tercih. GFP-dgnFS (kararlı) protein ve protazom inhibitörünün yokluğunda veya varlığında istikrarsız protein (GFP-DGN) tarafından gösterilen floresan arasındaki fark, her bir hücre soyu içinde ubiquitin-proteasome aktivitesi tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu farklılıklar Epifloresans mikroskopi ile takip edilebilir ya da akış sitometrisi ile ölçülebilir.
Protocol
Discussion
Ubikuitin-proteazom aktivitesi için bir muhabir substrat olarak yeşil floresan protein (GFP) kullanarak ilk yayın 2000 12 yayımlanmıştır. O zamandan beri, GFP hücresel faaliyetler, özellikle ubikuitin-proteazom işlemini görselleştirmek için ortak bir araç haline gelmiştir. In vivo ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek için bir GFP tabanlı muhabiri ile bir transgenik fare modelinde 13 girmiştir. In vivo araştırmalar bu yayın ile ilgili ek 14</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma tarafından finanse edildi: Avusturya Bilim Vakfı (FWF), Avrupa Komisyonu Entegre Projeler MiMAGE ve PROTEOMAGE, Hollanda Girişimi Genomics tarafından Yaşlanma (NFN S93) Ulusal Araştırma Ağı / Bilimsel Araştırma Hollanda Teşkilatı (NGI / NWO, 05.040.202 ve 050 – 060-810 NCHA), AB Mükemmellik Ömrü (FP6 036.894) Network finanse ve Genomik üzerinde Yenilik Odaklı Araştırma Programı (SenterNovem; IGE01014 ve IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
