Övervakning av ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler Använda en Degron (DGN)-destabiliseras grönt fluorescerande protein (GFP)-baserad Reporter protein
Summary
En metod för att övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler beskrivs. En degron-destabiliserade GFP-(GFP-DGN) och en stabil GFP-dgnFS fusionsprotein genereras och transduceras in i cellen med användning av en Lentiviral expressionsvektor. Denna teknik gör det möjligt att generera en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS uttryckande cellinje i vilken ubiquitin-proteasom aktivitet kan enkelt bedömas med epifluorescens eller flödescytometri.
Abstract
Proteasom är den viktigaste intracellulära organell involverade i den proteolytiska nedbrytningen av abnorma, felveckade, skadade eller oxiderade proteiner 1, 2. Underhåll av proteasom aktivitet inblandad i många viktiga cellulära processer, såsom cellens stressrespons 3, cellcykelreglering och cellulär differentiering 4 eller immunsystemet 5. Dysfunktion i den ubikitin-proteasom-systemet har kopplats till utvecklandet av tumörer och neurodegenerativa sjukdomar 4, 6. Dessutom observerades en minskning proteasom aktivitet hittades som en funktion av cellulärt åldrande och organismbiologi åldrande 7, 8, 9, 10. Här presenterar vi en metod för att mäta ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler med hjälp av en GFP-DGN fusionsprotein. För att kunna övervaka ubiquitin-proteasom aktivitet i levande primära celler, konstruerar komplementär DNA som kodar för ett grönt fluorescerande protein (GFP)-DGN fusionsprotein (GFP-DGN, unstable) och en variant som bär en ramskiftesmutation (GFP-dgnFS, stabil 11) sätts in i Lentiviral expressionsvektorer. Vi föredrar denna teknik jämfört med traditionella transfektionstekniker eftersom det garanterar en mycket hög transfektionseffektivitet oberoende av celltyp eller ålder hos givaren. Skillnaden mellan fluorescens visas av GFP-dgnFS (stabil) protein och den destabiliserade proteinet (GFP-DGN) i frånvaro eller närvaro av proteasomhämmare kan användas för att uppskatta ubiquitin-proteasom aktivitet i varje enskilt cellstam. Dessa skillnader kan övervakas genom epifluorescensmikroskopi eller kan mätas genom flödescytometri.
Protocol
Discussion
Den första publikationen med grönt fluorescerande protein (GFP) som reporter substrat för ubiquitin-proteasom aktivitet publicerades 2000 12. Sedan dess har GFP blivit ett vanligt verktyg för att visualisera cellulära aktiviteter, speciellt ubiquitin-proteasom process. För att övervaka ubikitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen musmodell med en GFP-baserad reporter har införts 13. Ytterligare in vivo-forskning, inrättat en transgen musmodell med en liknande degron-d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats av: National Research Network on Aging (NFN S93) av den österrikiska Science Foundation (FWF), Europeiska kommissionen integrerade projekt MiMAGE och PROTEOMAGE, Nederländerna Genomics Initiative / Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NGI / NWO, 05.040.202 och 050 – 060-810 NCHA), det EU-finansierade Network of Excellence Lifespan (FP6 036.894) och innovationsinriktade forskningsprogram om Genomics (SenterNovem, IGE01014 och IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
