رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس
Summary
يوصف أسلوب لمراقبة اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية. يتم إنشاء A-degron مزعزعة الاستقرار GFP-(GFP-DGN) ومستقرة انصهار بروتين GFP-dgnFS وtransduced في الخلية باستخدام ناقلات lentiviral التعبير. هذا الأسلوب يسمح لإنشاء خط خلية مستقرة GFP-dgn/GFP-dgnFS معربا عن الذي يمكن اليوبيكويتين-proteasome النشاط المقررة بسهولة باستخدام epifluorescence أو التدفق الخلوي.
Abstract
Proteasome هو عضية الرئيسي داخل الخلايا المشاركة في تدهور بروتين غير طبيعي من والبروتينات وتتجمع تلف أو المؤكسد 1 و 2. تورط استمرار نشاط proteasome في العديد من العمليات الخلوية الأساسية، مثل الاستجابة للضغط النفسي الخلية 3، تنظيم دورة الخلية والتمايز الخلوي 4 أو استجابة جهاز المناعة 5. وقد يرتبط ضعف النظام اليوبيكويتين-proteasome لنمو الاورام وأمراض الاعصاب 4 و 6. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على انخفاض في النشاط proteasome كنمط من أنماط الشيخوخة الخلوية والشيخوخة العضوي 7 و 8 و 9 و 10. هنا، نقدم طريقة لقياس اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية باستخدام البروتين GFP-DGN الانصهار. لتكون قادرة على رصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الخلايا الحية الأولية، DNA مكملة لترميز يبني البروتين الفلوري الأخضر (GFP)-DGN انصهار بروتين (GFP-يتم إدراج DGN، غير مستقر) ومتغير يحمل طفرة انزياح الإطار (GFP-dgnFS ومستقرة 11) في التعبير lentiviral ناقلات. نحن نفضل هذا الأسلوب أكثر الأساليب التقليدية لأنها ترنسفكأيشن يضمن كفاءة عالية جدا ترنسفكأيشن مستقلة عن نوع من الخلايا أو سن المتبرع. ويمكن استخدام الفرق بين مضان المعروضة بواسطة GFP-dgnFS (مستقر) والبروتين البروتين زعزعة الاستقرار (GFP-DGN) في غياب أو وجود المانع proteasome لتقدير اليوبيكويتين-proteasome النشاط في كل سلالة خلية معينة. يمكن رصد هذه الاختلافات بواسطة المجهر epifluorescence أو يمكن قياس التدفق الخلوي من قبل.
Protocol
Discussion
وقد نشرت أول نشر باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باعتبارها الركيزة مراسل اليوبيكويتين-proteasome النشاط في 2000 12. ومنذ ذلك الحين، أصبح GFP أداة مشتركة لتصور الأنشطة الخلوية، وخاصة عملية اليوبيكويتين-proteasome. لرصد اليوبيكويتين-proteasome النشاط في الجسم الحي وقد ت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل: شبكة البحوث الوطني للشيخوخة (نفن S93) من قبل مؤسسة العلوم النمساوية (FWF)، والمفوضية الأوروبية المتكاملة MiMAGE المشاريع وPROTEOMAGE، هولندا الجينوم مبادرة / المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (NGI / NWO؛ و05040202 050 – 060-810 NCHA)، ويموله الاتحاد الأوروبي من فترة الحياة شبكة التميز (FP6 036894)، وبرنامج البحوث الموجهة نحو الابتكار على علم الجينوم (SenterNovem؛ IGE01014 وIGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
