Overvågning af Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjælp af en Degron (DGN)-destabiliseret Green Fluorescent Protein (GFP)-baseret Reporter Protein
Summary
Fremgangsmåde til overvågning Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler er beskrevet. En degron-destabiliseret GFP-(GFP-DGN) og en stabil GFP-dgnFS fusionsprotein genereres og transduceres ind i cellen under anvendelse af en lentiviral ekspressionsvektor. Denne teknik gør det muligt at generere en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS udtrykkende cellelinie, hvori Ubiquitin-proteasom aktivitet kan let vurderes ved hjælp af epifluorescens eller flowcytometri.
Abstract
Proteasom er den vigtigste intracellulære organel involveret i den proteolytiske nedbrydning af unormale, fejlfoldede, beskadigede eller oxiderede proteiner 1, 2. Vedligeholdelse af proteasom aktivitet blev impliceret i mange vigtige cellulære processer, ligesom celle stress reaktion 3, cellecyklusregulering og cellulær differentiering 4 eller i immunsystemet respons 5. Dysfunktion af den ubiquitin-proteasom system er blevet forbundet med udviklingen af tumorer og neurodegenerative sygdomme 4, 6. Desuden blev et fald i proteasom aktivitet fundet som en funktion af cellulære ældning og organismal aldring 7, 8, 9, 10. Her præsenteres en metode til måling af ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjælp af en GFP-DGN fusionsprotein. At kunne overvåge Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende primære celler, komplementære DNA-konstruktioner der koder for et grønt fluorescerende protein (GFP)-DGN fusionsprotein (GFP-DGN og ustabil) og en variant bærer en rammeskift mutation (GFP-dgnFS, stabile 11) indsættes i lentivirale ekspressionsvektorer. Vi foretrækker denne teknik over traditionelle transfektionsteknikker, fordi den sikrer en meget høj transfektionseffektivitet uafhængig af den celletype eller alder donoren. Forskellen mellem fluorescens vises af GFP-dgnFS (stabilt) protein og destabiliseret protein (GFP-DGN) i fravær eller nærvær af proteasom inhibitor kan anvendes til at estimere Ubiquitin-proteasom aktivitet i hvert enkelt cellestamme. Disse forskelle kan overvåges ved epifluorescens-mikroskopi eller kan måles ved flowcytometri.
Protocol
Discussion
Den første offentliggørelse ved hjælp af grønt fluorescerende protein (GFP) som en reporter substrat for ubiquitin-proteasom aktivitet blev offentliggjort i 2000 12. Siden da har GFP blive et fælles redskab til at visualisere cellulære aktiviteter, navnlig den ubiquitin-proteasom proces. At overvåge Ubiquitin-proteasom aktivitet de vivo en transgen musemodel med et GFP-baseret reporter er blevet indført 13. Yderligere in vivo forskning etableret en anden transgen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af: National Research Network on Aging (NFN S93) af den østrigske Science Foundation (FWF), Europa-Kommissionen integrerede projekter MiMAGE og PROTEOMAGE, Holland Genomics Initiative / Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NGI / NWO, 05.040.202 og 050 – 060-810 NCHA), EU-finansierede Network of Excellence Levetid (FP6 036.894), og Innovation Oriented Research Program på Genomics (SenterNovem, IGE01014 og IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
