Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein
Summary
Werkwijze voor ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen te volgen beschreven. Een degron-gedestabiliseerd GFP-(GFP-dgn) en een stabiele GFP-fusie-eiwit dgnFS gegenereerd en wordt getransduceerd in de cel met een lentivirale vector expressie. Deze techniek maakt het mogelijk om een stabiel GFP-dgn/GFP-dgnFS expressie cellijn waarin ubiquitine-proteasoom activiteit gemakkelijk worden bepaald onder toepassing epifluorescentie of flowcytometrie.
Abstract
Proteasoom is de belangrijkste intracellulaire organellen betrokken bij de proteolytische afbraak van abnormale, verkeerd gevouwen, beschadigd of geoxideerde eiwitten 1, 2. Onderhoud van proteasoom activiteit werd betrokken bij veel belangrijke cellulaire processen, zoals stress cel respons 3, celcyclus regulatie en cellulaire differentiatie 4 of in het immuunsysteem reactie 5. Het disfunctioneren van de ubiquitine-proteasoom-systeem is gerelateerd aan de ontwikkeling van tumoren en neurodegeneratieve ziekten 4, 6. Daarnaast werd een afname in activiteit gevonden proteasoom als functie van cellulaire ouderdom en veroudering organismale 7, 8, 9, 10. Hier geven we een methode om ubiquitine-proteasoom te meten in levende cellen met een GFP-fusie-eiwit dgn. Om ubiquitine-proteasoom activiteit volgen in levende elementen, complementaire DNA constructen die coderen voor een groen fluorescerend eiwit (GFP)-dgn fusie-eiwit (GFP-dgn, unstable) en een variant die een frameshift mutatie (GFP-dgnFS, stabiele 11) ingevoegd in lentivirale expressievectoren. We verkiezen deze techniek meer traditionele transfectietechnieken omdat het garandeert een zeer hoge transfectie-efficiëntie onafhankelijk van het celtype of de leeftijd van de donor. Het verschil tussen fluorescentie weergegeven door de GFP-dgnFS (stable) eiwit en de gedestabiliseerd eiwit (GFP-dgn) in de afwezigheid of aanwezigheid van proteasoom inhibitor kan worden gebruikt om ubiquitine-proteasoom activiteit schatten in elk afzonderlijk cellijn. Deze verschillen kunnen worden gecontroleerd door epifluorescentiemicroscopie of kan worden gemeten door middel van flowcytometrie.
Protocol
Discussion
De eerste publicatie met green fluorescent protein (GFP) als reporter substraat voor ubiquitine-proteasoom-activiteit werd gepubliceerd in 2000 12. Sindsdien is GFP uitgegroeid tot een gemeenschappelijk instrument om cellulaire activiteiten, in het bijzonder het ubiquitine-proteasoom-proces te visualiseren. Om ubiquitine-proteasoom activiteit in vivo volgen van een transgeen muismodel met een GFP-reporter gebaseerde geïntroduceerd 13. Extra in vivo onderzoek bleek een transgeen m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door: National Research Network on Aging (NFN S93) door de Oostenrijkse Science Foundation (FWF), Europese Commissie geïntegreerde projecten MiMAGE en PROTEOMAGE, Nederland Genomics Initiative / Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NGI / NWO, 05040202 en 050 – 060 tot 810 NCHA), de door de EU gefinancierde Network of Excellence Levensduur (KP6 036.894), en Innovatiegerichte onderzoeksprogramma over Genomics (SenterNovem, IGE01014 en IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
