ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב
Summary
שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.
Abstract
הפרוטאזום הוא אברון התאי העיקרי מעורב בפירוק החלבונים של חלבונים, לא תקינים, misfolded פגום או מתחמצנים 1, 2. תחזוקה של פעילות הפרוטאזום הייתה מעורבת בתהליכים תאיים חשובים רבים, כמו תגובתו של תא לחץ 3, רגולצית מחזור תא והתמיינות תאי 4 או בתגובה של מערכת חיסון 5. התפקוד הלקוי של מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום כבר קשור להתפתחות של גידולים ומחלות ניווניות 4, 6. בנוסף, ירידה בפעילות הפרוטאזום נמצאה כתכונה של הזדקנות תאית והאורגניזם 7 הזדקנות, 8, 9, 10. כאן, אנו מציגים שיטה למדידת פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים באמצעות חלבון היתוך GFP-DGN. כדי להיות מסוגלת לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאים חיים ראשוניים, הדנ"א משלים בונה מקודד חלבון היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) DGN-(GFP-DGN, לא יציב) וריאנט נושא מוטצית frameshift (GFP-dgnFS, 11 יציבים) מוכנסים בוקטורי הביטוי lentiviral. אנחנו מעדיפים טכניקה זו על טכניקות מסורתיות transfection כי זה מבטיח יעילות transfection גבוהה מאוד תלוי בסוג התא או גילו של התורם. ההבדל בין פלואורסצנטי מוצג על ידי GFP-dgnFS (יציב) החלבון והחלבון המעורער (GFP-DGN) בהעדר או הנוכחות של מעכבי הפרוטאזום ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בכל מתח תא מסוים. הבדלים אלה יכולים להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ epifluorescence או ניתן למדוד על ידי cytometry זרימה.
Protocol
Discussion
הפרסום הראשון באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמצע לפעילות כתב היוביקוויטין-הפרוטאזום פורסם בשנת 2000 12. מאז, GFP הפך לכלי נפוץ לדמיין פעילות הסלולר, במיוחד בתהליך היוביקוויטין-הפרוטאזום. כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום in vivo במודל עכבר מהונדס …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי: רשת מחקר הלאומי להזדקנות (NFN S93) על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF), הנציבות האירופיות המשולב MiMAGE פרויקטים וPROTEOMAGE, הולנד ג'נומיקס יוזמה / ארגון הולנד למחקר מדעי (NGI / NWO; 05040202 ו050 – 060-810 NCHA), האיחוד האירופי במימון רשת של אקסלנס תוחלת חיים (FP6 036894), וחדשנות תכנית מוכוונת מחקר על ג'נומיקס (SenterNovem; IGE01014 וIGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
