デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質
Summary
生きた細胞内でユビキチン – プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン – 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン – プロテアソーム活性を容易に落射蛍光またはフローサイトメトリーを用いて評価することができる安定したGFP-dgn/GFP-dgnFS発現する細胞株を生成することができます。
Abstract
プロテアソームは異常、誤って折り畳まれた、破損したり、酸化されたタンパク質1、2のタンパク質分解に関与する主な細胞内小器官である。プロテアソーム活性の維持は、細胞のストレス応答3、細胞周期の調節と細胞分化4または免疫システムの応答5のように、多くの重要な細胞プロセスに関与していた。ユビキチン-プロテアソーム系の機能不全は、腫瘍および神経変性疾患4、6の開発に関係している。さらに、プロテアソーム活性の低下は、細胞老化と生物の老化7、8、9、10の特徴として見出された。ここで、我々は、GFP-DGN融合タンパク質を用いて、生細胞におけるユビキチン – プロテアソーム活性を測定する方法を提案する。初代培養細胞を生体内でユビキチン – プロテアソーム活性をモニターすることができるように、相補的DNA（緑色蛍光タンパク質（GFP）-DGN融合タンパク質をコードする構築物のGFPDGN、不安定な）とフレームシフト突然変異を運ぶバリアント（GFP-dgnFS、安定した11）レンチウイルス発現ベクターに挿入されます。それは細胞のタイプやドナーの年齢とは無関係非常に高いトランスフェクション効率を保証しますので、我々は伝統的なトランスフェクション技術を介して、この手法を好む。プロテアソーム阻害剤の非存在下または存在下でGFP-dgnFS（安定した）タンパク質と不安定化タンパク質（GFP-DGN）によって表示される蛍光の差は、それぞれの特定の細胞株ではユビキチン – プロテアソーム活性を推定するために使用することができます。これらの違いは、落射蛍光顕微鏡によって監視することができますまたはフローサイトメトリーで測定することができる。
Protocol
Discussion
ユビキチン-プロテアソーム活性のためのレポーター基質として緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた最初の出版は2000年12年に出版された。それ以来、GFPは細胞の活動、特にユビキチン – プロテアソームプロセスを可視化するための共通のツールとなっています。 in vivoでのユビキチン-プロテアソーム活性をモニターするために、GFP-ベースのレポータートランスジェニックマ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はによって資金を供給された：オーストリア科学財団（FWF）によるエージング（NFN S93）、欧州委員会の統合プロジェクトMiMAGEとPROTEOMAGE、科学研究費オランダゲノミクスイニシアティブ/オランダ機構（NGI / NWOの国立研究ネットワーク、05040202と050 – 060から810 NCHA）、優秀寿命（FP6 036894）、およびゲノミクスのイノベーション指向研究プログラム（SenterNovemのEUの資金ネットワーク; IGE01014とIGE5007）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
