살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여
Summary
생활 세포의 ubiquitin proteasome – 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.
Abstract
Proteasome은 이상, misfolded, 손상되었거나 산화 단백질 1, 2의 proteolytic 저하에 관련된 주요 세포 세포 기관입니다. proteasome 활동의 유지 보수는 세포의 스트레스 반응 3, 세포주기 조절과 세포 분화 4 면역 체계의 반응 5와 같은 많은 주요 세포 프로세스에 연루되었습니다. ubiquitin proteasome – 시스템의 장애는 종양 및 neurodegenerative 질병 4, 6의 개발에 관한되었습니다. 또한, proteasome 활동에 감소는 세포 노화 및 노화 organismal 7, 8, 9, 10의 기능으로 발견되었다. 여기, 우리는 GFP-dgn 융합 단백질을 사용하여 생활 세포에 ubiquitin-proteasome 활동을 측정하는 방법을 제시한다. 기본 세포를 생활에 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 있도록, 보완 DNA는 (녹색 형광 단백질 (GFP) dgn 융합 단백질에 대한 코딩 구성합니다 GFP-dgn, 불안정)과 frameshift 변이 (GFP-dgnFS, 안정적 11) 운반 변종 lentiviral 표현 벡터에 삽입되어 있습니다. 이 셀 형식이나 기증자의 나이와 무관 한 매우 높은 transfection 효율을 보장하기 때문에 우리는 기존의 transfection 기술을 통해이 기술을 선호합니다. GFP-dgnFS (안정적) 단백질과 proteasome 억제제의 부재 또는 존재의 불안정 단백질 (GFP-dgn)에 의해 표시되는 형광의 차이점은 각 특정 세포 변형에 ubiquitin-proteasome 활동을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 epifluorescence 현미경에 의해 모니터링 될 수 있거나 유동 세포 계측법에 의해 측정 할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
ubiquitin proteasome – 활동 기자 기판으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 첫 번째 출판 2000 12 년에 출판되었다. 그 후, GFP 세포 활동, 특히 ubiquitin-proteasome 프로세스를 시각화 할 수있는 일반적인 도구가되었습니다. 생체 내 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 GFP 기반 기자와 유전자 변형 마우스 모델은 13 도입되었습니다. 생체 연구에 추가이 간행물 14에서 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는이 지원되었습니다 오스트리아 과학 재단 (FWF), 유럽위원회 (European Commission) 통합 프로젝트 MiMAGE과 PROTEOMAGE, 네덜란드 이니셔티브 유전체학에 의한 노화 (NFN S93)에서 국립 연구 네트워크 / 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (NGI / NWO, 05040202과 050 – 060-810 NCHA), 유럽 연합 (EU)은 우수 수명 (FP6 036894)의 네트워크를 재정 지원하고, 유전체학에 대한 혁신 지향 연구 프로그램 (SenterNovem, IGE01014 및 IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
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