Overvåking av Ubiquitin-proteasome aktivitet i levende celler ved hjelp av en Degron (DGN)-destabilisert grønt fluorescerende protein (GFP)-baserte reporter Protein
Summary
En metode for å overvåke ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler er beskrevet. En degron-destabilisert GFP-(GFP-DGN) og en stabil GFP-dgnFS fusjonsprotein genereres og transduced inn i cellen ved hjelp av en lentiviral ekspresjonsvektor. Denne teknikken gjør det mulig å generere en stabil GFP-dgn/GFP-dgnFS uttrykke cellelinje der ubiquitin-proteasom aktivitet kan lett vurdert ved hjelp epifluorescence eller flowcytometri.
Abstract
Proteasome er den viktigste intracellulære organeller involvert i proteolytisk nedbrytning av unormale, misfolded, skadet eller oksidert proteiner 1, 2. Vedlikehold av proteasome aktivitet ble innblandet i mange viktige cellulære prosesser, som celle stressrespons 3, cellesyklus regulering og cellulær differensiering 4 eller i immunsystemet respons fem. Dysfunksjon av ubiquitin-proteasom systemet har vært knyttet til utvikling av svulster og nevrodegenerative sykdommer 4, 6. I tillegg ble en reduksjon i proteasom aktivitet funnet som en funksjon av cellulær senescence og organismebiologi 7 aldring, 8, 9, 10. Her presenterer vi en metode for å måle ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjelp av en GFP-DGN fusion protein. Å være i stand til å overvåke ubiquitin-proteasom i levende primære celler, konstruerer komplementær DNA som koder for et grønt fluorescerende protein (GFP)-DGN fusjonsprotein (GFP-DGN og ustabil) og en variant som bærer en frameshift mutasjon (GFP-dgnFS, stabil 11) er satt inn i lentiviral ekspresjonsvektorer. Vi foretrekker denne teknikken over tradisjonelle transfeksjon teknikker fordi det garanterer en meget høy transfeksjon virkningsgrad uavhengig av celletypen eller alderen på giveren. Forskjellen mellom fluorescens som vises av GFP-dgnFS (stabil) protein og destabilisert protein (GFP-DGN) i fravær eller nærvær av proteasominhibitor kan brukes til å estimere ubiquitin-proteasom aktivitet i hvert enkelt cellestamme. Disse forskjellene kan overvåkes av epifluorescence mikroskopi eller kan måles ved strømningscytometri.
Protocol
Discussion
Den første publikasjonen med grønt fluorescerende protein (GFP) som reporter substrat for ubiquitin-proteasom aktivitet ble publisert i 2000 12. Siden da har GFP blitt et vanlig verktøy for å visualisere cellulære aktiviteter, spesielt ubiquitin-proteasom prosess. Å overvåke ubiquitin-proteasom aktivitet in vivo en transgen mus modell med en GFP-baserte reporter har blitt innført 13. Ytterligere in vivo undersøkelser etablert en transgen mus modell med en lignende degron-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av: National Research Network on Aging (NFN S93) av den østerrikske Science Foundation (FWF), EU-kommisjonen integrerte prosjekter MiMAGE og PROTEOMAGE, Nederland Genomics Initiative / nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NGI / NWO, 05040202 og 050 – 060-810 NCHA), EU finansiert Network of Excellence Levetid (FP6 036894), og Innovasjon forskningsprogram på Genomics (SenterNovem, IGE01014 og IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
