Summary
כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובה חיסונית לאורך זמן בתוך העכבר זאת, בלוטות הלימפה ניתן להסיר ברצף על ידי ניתוח. כאן, אנו מתארים כיצד טכניקה זו ניתן לבצע.
Abstract
בתחום אימונולוגיה, להבין את התקדמות התגובה החיסונית נגד החיסון, זיהום או גידול, התגובה מלווה לעיתים קרובות לאורך זמן. באופן דומה, המחקר של הומאוסטזיס לימפוציטים דורש כמובן ניסויים זמן. ביצוע מחקרים אלו בתוך העכבר אותו הוא אידיאלי כדי להפחית את השתנות ניסיוני, כמו גם את מספר העכברים המשמשים. הנסיגה הדם מאפשרת ביצוע ניסויים כמובן זמן, אבל זה רק נותן מידע על מחזורי לימפוציטים ומספק מספר מוגבל של תאים 1-4. מאז לימפוציטים במחזור דרך הגוף המתגוררים בלוטות הלימפה יש מאפיינים שונים, חשוב לבחון את שני המקומות. הסרת רציפה של בלוטות הלימפה על ידי ניתוח מספק הזדמנות ייחודית לבצע תגובה חיסונית או הרחבת התא החיסונית של העכבר באותו הזמן. יתר על כן, שיטה זו מניבה בין 1-2x10 6 תאים בכל מפרק הלימפה אשר די PErform אפיון פנוטיפי ו / או מבחני תפקודית. לימפה הצומת רציף ניתוח או lymphadenectomy שימש בהצלחה על ידינו ואחרים 5-11. כאן, אנו מתארים כיצד בלוטות הלימפה הזרוע ואת מפשעתי ניתן להסיר על ידי ביצוע חתך קטן בעור של עכבר anesthetised. מאז הניתוח היא שטחית של דבר במהירות, עכבר מתאושש מהר מאוד, מחלים היטב ואינו לחוות כאב מוגזם. כל יום 2, ניתן לקצור אחת או שתיים בלוטות הלימפה המאפשר ניסויים כמובן זמן. טכניקה זו מתאימה ובכך ללמוד את המאפיינים של בלוטת לימפה לימפוציטים המתגוררים לאורך זמן. גישה זו מתאימה עיצובים ניסיוניים שונים ואנו מאמינים כי במעבדות רבות ירוויחו ביצוע ניתוחים עוקבים הצומת לימפה.
Protocol
1. הכנה לפני הניתוח
העכברים טופלו בהתאם המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים.
- עכברים Anesthetise על ידי הזרקה של קטמין / xylazine (150/300 מ"ג / ק"ג, ה-IP) או על ידי שאיפה של isoflurane (2% חמצן 1 ליטר). אם ניתן, יש להשתמש isoflurane שכן היא מאפשרת שליטה טובה יותר של זמן ועומק ההרדמה. כמו כן, ניתנת חמצן בעת ובעונה אחת התומכת את הפונקציות הפיזיולוגיות של החיה. יתר על כן, isoflurane מסולק ישירות על ידי הריאות, ולכן אינו מחייב את חילוף החומרים בכבד או בכליות.
- להזריק עצירות (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, SC) או אחר משכך כאבים.
- החל משחה על העיניים העכבר לפני הניתוח, כדי למנוע יובש בעיניים (אם isoflurane משמש).
- ודא עכבר ישן של צובט ברגל, מגלגל את זנבו. אם העכבר לא מגיב, להמשיך עם הניתוח.
2. כירורגיה
class = "jove_content"> ניתן להסיר 4 של בלוטות הלימפה השטחיות (LN) על ידי ניתוח: 2 מפשעתי לבין הזרוע 2. הבידוד של LN קל יותר בעכברים רזים צעירים (6-8 שבועות) מאז נוכחות של רקמת שומן אצל עכברים מבוגרים יכולים להפריע בידוד LN. עם זאת, מגבלה זו היא להתגבר עם אותו לחזור על התרגילים. לנוחות עכברים, אנו לקצור מקסימום 2 LNs בכל פעם, כאשר אנו מבצעים בזמן הקורס ניסויים, אנחנו קוצרים LNs כל יום 2. כמו כן, כדי למנוע זיהום, אנטיביוטיקה יכולה להינתן העכבר, אבל אנחנו לא והפצעים הם ריפוי בסדר גמור. אחד צריך להיות מודע לכך בהתאם לעיצוב ניסיוני, שימוש באנטיביוטיקה יכול להשפיע על התוצאה ציין (לדוגמה, אם בעקבות חיידק נמדד). שים לב שכל המכשירים מעוקרים לאחר כל שימוש ותנאי אספטיים נשמרים לאורך כל ההליכים.
- שים את העכבר על צדו.
- למקם את האזור שבו תוכלו לבצע incision, בהתאם LN אתה רוצה לקצור. (איור 1).
- החל כלורהקסידין או חומר חיטוי אחר, לאזור זה.
- לעשות חתך קטן במספריים חדות (כ 5 מ"מ) או בצד האחורי של רגלו הקדמית ומעלה כפה האחורית ליד הבטן (איור 1).
- הסר את שערות שנשרו שגזרת עם המלקחיים. אם אתה מעדיף, אתה יכול לגלח את העכבר לפני ביצוע החתך. עם זאת, היא מאריכה את ההליך, ואנחנו חושבים שזה לא נחוץ, שכן, כפי שמוצג כאן, זה לא לשפר את הריפוי או ירידה בזיהום, אשר הן נדירות מאוד.
- למתוח את החתך עם 2 מלקחיים כדי לראות LN. החתך עשוי להגיע 10 מ"מ. LN נראה אפור או כהה יותר שומן שמסביב.
- לצבוט fascia (קרום דק המכסה את שומן ורקמות) על גבי LN אחד עם מלקחיים ומושכים קלות בלי לשבור את הרקמה שמסביב.
- מניחים את מלקחיים השני ככל האפשר underneath LN. עם מלקחיים הראשונים לשבור את fascia ולהסיר LN. אם קוצרים בהצלחה LN, כתם הדם אמור להופיע במקום שבו היה ממוקם בעבר LN. שים לב הוזהרו כיורים בתמיסה איזוטונית. זו בדיקה פשוטה מאפשר לך לאמת כי חילצת LN ורקמת השומן לא.
- לוודא כי השיער לא נמצא הפצע.
- סגירת החתך על ידי דבק את 2 החלקים של העור יחד (החלק הפנימי של העור) ועל ידי הידוק להם קליפ. אנו משתמשים קצת קליפ מישל עם מלקחיים החלים. התקן אחד או 2 קליפים בהתאם לגודל של החתך. לרוב, קליפים ליפול כאשר הרקמה מרפא.
3. לאחר הניתוח טיפול
- להוסיף קצת מזון רטוב אל החלק התחתון של הכלוב אז העכברים יכול להאכיל בקלות לאחר הניתוח.
- 6 עד 8 שעות לאחר הניתוח, לבדוק את העכברים כדי לוודא שהם אינם חווים כאב. בזהירות לבחון את התנהגותם (היציבה, ההליכה, עלteraction עם כמשלימתו והמראה של הפרווה). אם המראה הכללי של העכברים הוא עני, לנהל את המנה השנייה של עצירות. למחרת העכברים צריכים להחזיר את ההתנהגות הרגילה אחרת להמשיך את הניהול של עצירות. העכברים לא צריך להגיע אל נקודות הקצה שנקבעו קודם לכן, התקבלה על ידי מועצת שלך Animal Care. אולי כדאי לך להתייעץ ולעזור מן החי טכנאי טיפול ביבר.
4. הלימפה טיפול
- במעבדה, כדי להשיג הפסקת תא בודד, לנתק LN על פי הנוהל הרגיל שלך. אנחנו הקש LN נגד שקופיות הקפואות ובאופן שגרתי לקבל 1-2 x 10 6 תאים לכל LN. לחילופין, אנו מכינים LN להפקת RNA.
- כתם התאים לפי הפרוטוקול הרגיל שלך. אתה צריך להשיג צפוי תזרים הוזהרו פרופילים cytometry.
5. נציג תוצאות
דוגמה עמ 'פיזור קדימה בצדהרבה מוצג עבור LNs שנקטפו מן העכבר על ידי ניתוח בהרדמה או עכבר הקריב (איור 2). הפרופיל של אחוזי התאים בשער הלימפוציטים חיים זהים הוכחת כי ניתוח LN הוא הטכניקה המתאימה לתאי הקציר.
באיור 1. מפשעתי ולוקליזציה LN הזרוע של העכבר. א LN מפשעתי ממוקם בדיוק מעל כף רגל אחורית, מעט לכיוון הבטן. ב LN הזרוע ממוקם מאחורי רגלו הקדמית.
2. תרשים זרימה cytometry פרופיל של לימפוציטים שהושג לאחר הניתוח LN. פרופילים פיזור קדימה לצד מוצגים LNs שנקטפו מן anesthעכבר etized על ידי ניתוח () או עכבר הקריב (ב '). LNs נקצרו, ניתק ונותחו על cytometer הזרימה. אחוזי התאים הלימפוציטים השער חי מוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיארנו פרוטוקול הניתוח LN אשר יכול לחול על מערכות ניסיוניות רבות. אמנם שימושי מאוד לעקוב אחר התגובות החיסוניות או הומאוסטזיס תא החיסון, טכניקה זו יש מספר מגבלות. ראשית, רק 4 LNs ניתן לקצור. שנית, התגובה החיסונית למד חייב להיות מערכתי או להתרחש שטחיות (עור, ניקוז) LNs מפשעתי או הזרוע. לבסוף, מספר תאים שנקטפו מושפעת מאיכות הסרת LN, מגבלה טכנית אשר עשוי לתרום שונות ניסיוני כאשר מספרים מוחלטת לתא יש צורך. עם זאת, אחוז התאים היעד, בפני עצמו, יכול לספק מידע רלוונטי ומדויק במיוחד כאשר גודל LN אינו משתנה על פני תנאי הניסוי השונים. למרבה המזל, ברגע הטכניקה הוא שולט היטב, איכות הסרת LN משפר, המאפשר מספרים סלולריים לשחזור ביותר ב LN זה. אנו מאמינים כי על אף המגבלות האלה מעטים, ניתוח LN מספק יתרונות מרכזיים ללמודהתקדמות התגובה החיסונית. ראשית, התגובה החיסונית לאורך זמן ניתן לעקוב בעכבר נתון, הפחתת השונות ניסיוני, כמו גם את מספר העכברים המשמשים. שנית, אירועים כגון הומאוסטזיס הלימפוציטים או התחלת התגובה החיסונית המתרחשים LNs ניתן ללמוד באופן ישיר. יתרון נוסף חשוב הוא כי תאים נוספים ניתן לשחזר מ LNs מאשר דם המאפשרת אפיון תאים המורחבת. טכניקה זו מתאימה גם למטרות אחרות כגון genotyping העכברים הטרנסגניים, או ללמוד אוכלוסיות תאים אחרים המתגוררים או סחר דרך LNs כמו בתאי B, תאים דנדריטים ומקרופגים.
המעבדה שלנו ואחרים כבר משתמש בטכניקה זו במשך כמה שנים, אנחנו אף פעם לא הבחינו כל הפרעה על מהלך התגובה החיסונית 7-9,12,13 ועל הומאוסטזיס החיסונית 5-7. ניתוח LN רציפים ב נח wild-type C57BL / 6 עכברים לא השפיע על אחוז ומספר CD4 + + T תאים 5-7. יתר על כן, הוא גם לא השפיעו על פרמטרים אלה של LNs שיורית. יתר על כן, במהלך תגובה חיסונית, הסרת LN שטחית לא השפיע על קינטיקה של התגובה תא T ולא דור של ה-T לתאים זיכרון 8,9,12,13. יתר על כן, צד בצד השוואה של התגובה תא T אחריו או על ידי ניתוח LN רציפים או הקריב את העכבר לא הראה את כל ההבדלים ידינו (תוצאות שלא פורסמו ו איור 2). לכן, ניתוח LN רציפים מתאים ללמוד הומאוסטזיס בתגובה תא T ו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים Lesage סילבי וכל חברי המעבדה של קריאה ביקורתית של פרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענק (MOP-77545) מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). נטלי Labrecque נתמך על ידי מלגה בכיר FRSQ ומליסה מתייה קיבל אלכסנדר גרהם בל NSERC קנדה מלגות לתואר שני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
