Summary
एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के ही माउस भीतर समय के साथ प्रगति का पालन करने के लिए, लिम्फ नोड्स sequentially सर्जरी द्वारा हटाया जा सकता है. यहाँ, हम वर्णन कैसे इस तकनीक का प्रदर्शन किया जा सकता है.
Abstract
इम्मुनोलोगि के क्षेत्र में, एक टीका, एक संक्रमण या एक ट्यूमर के खिलाफ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रगति को समझने में, प्रतिक्रिया अक्सर समय के साथ पीछा किया जाता है. इसी तरह, लिम्फोसाइट homeostasis के अध्ययन पाठ्यक्रम प्रयोगों की आवश्यकता है. एक ही माउस के भीतर इन अध्ययनों प्रदर्शन प्रयोगात्मक रूप में अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल चूहों की संख्या परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए आदर्श है. रक्त वापसी समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के प्रदर्शन की अनुमति देता है, लेकिन यह ही लिम्फोसाइटों परिसंचारी के बारे में जानकारी देता है और 1-4 कक्षों की एक सीमित संख्या प्रदान करता है. के बाद से शरीर के माध्यम से परिसंचारी और लिम्फ नोड्स में रहने लिम्फोसाइटों अलग गुण है, यह महत्वपूर्ण है दोनों स्थानों की जांच की. अनुक्रमिक हटाने सर्जरी द्वारा लिम्फ नोड्स के एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या समय पर एक ही माउस में प्रतिरक्षा सेल विस्तार का पालन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. इसके अलावा, इस तकनीक 1 - 2x10 लिम्फ नोड 6 प्रतिशत कोशिकाओं के बीच पैदावार जो पे के लिए पर्याप्त हैप्ररूपी लक्षण वर्णन और / या कार्यात्मक assays rform. अनुक्रमिक लसीका नोड सर्जरी या lymphadenectomy सफलतापूर्वक किया गया है हमारे और दूसरों के 5-11 के द्वारा प्रयोग किया जाता है. यहाँ, हम वर्णन कैसे बाहु और वंक्षण लिम्फ नोड्स एक anesthetised माउस की त्वचा में एक छोटा सा चीरा द्वारा हटाया जा सकता है. के बाद सर्जरी सतही और तेजी से किया है, माउस बहुत जल्दी ठीक है, अच्छी तरह से भर देता है और अत्यधिक दर्द का अनुभव नहीं है. हर दूसरे दिन, यह संभव है फसल एक या दो लिम्फ नोड्स समय बेशक प्रयोगों के लिए अनुमति देता है. इस तकनीक को इस तरह समय के साथ लसीका नोड की विशेषताओं रहने लिम्फोसाइटों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है. इस दृष्टिकोण के विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए उपयुक्त है और हम मानते हैं कि कई प्रयोगशालाओं अनुक्रमिक लसीका नोड सर्जरी के प्रदर्शन से लाभ होगा.
Protocol
1. सर्जरी से पहले तैयारी
चूहे पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार इलाज किया गया.
- चतनाशून्य करना चूहों, ketamine / xylazine (150/300 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) के इंजेक्शन या isoflurane की साँस लेना (2%, 1L ऑक्सीजन) के द्वारा. यदि उपलब्ध है, के रूप में यह संज्ञाहरण समय और गहराई का एक बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है isoflurane इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अलावा, ऑक्सीजन जो पशु की शारीरिक कार्यों का समर्थन करता है एक ही समय पर किया जाता है. इसके अलावा, isoflurane सीधे फेफड़ों द्वारा समाप्त हो जाता है और इस तरह यकृत या गुर्दे चयापचय की आवश्यकता नहीं है.
- या किसी अन्य एनाल्जेसिक (0.1 मिलीग्राम / किलो, सुप्रीम कोर्ट 0.05) buprenorphine इंजेक्षन.
- माउस आँखों पर मरहम लागू सर्जरी से पहले आंख सूखापन से बचने के लिए (अगर isoflurane प्रयोग किया जाता है).
- सत्यापित करें कि माउस अपने हाथ बन्द रखो और इसकी पूंछ रोलिंग द्वारा सो रहा है. यदि माउस प्रतिक्रिया नहीं करता है, सर्जरी के साथ आगे बढ़ना.
2. सर्जरी
- अपने पक्ष पर माउस रखो.
- क्षेत्र जहाँ आप एक incisio प्रदर्शन स्थानीय बनानाएन, एलएन तुम फसल के लिए करना चाहते हैं पर निर्भर करता है. (चित्रा 1).
- , Chlorhexidine, या एक और निस्संक्रामक कि क्षेत्र के लिए लागू होते हैं.
- तेज कैंची (5 मिमी के बारे में) या तो अगली टांग की पीठ पर या पेट के पास हिंद पंजा (चित्रा 1) के ऊपर के साथ एक छोटे चीरा.
- आप संदंश साथ काट दिया है ढीला बाल निकालें. यदि आप चाहें, तो आप चीरा बनाने से पहले माउस दाढ़ी सकता है. हालांकि, यह प्रक्रिया lengthens और हम पाते हैं कि यह आवश्यक नहीं है के बाद से, जैसा कि यहाँ दिखाया, यह चिकित्सा या कम संक्रमण है, जो दोनों बहुत ही दुर्लभ हैं में सुधार नहीं करता है.
- 2 संदंश के साथ चीरा मांसपेशियों क्रम में एलएन देखना. चीरा 10 मिमी तक पहुँच सकता है. एलएन भूरा या गहरा आसपास के वसा से प्रकट होता है.
- प्रावरणी (पतली झिल्ली को कवर वसा और ऊतक) एक संदंश के साथ एलएन के शीर्ष पर चुटकी और आसपास के ऊतकों को तोड़ने के बिना हल्के से खींच.
- 2 संदंश जगह जहाँ तक संभव undeएलएन rneath. पहले संदंश के साथ, प्रावरणी तोड़ने के लिए और एलएन को हटा दें. यदि आप सफलतापूर्वक एलएन काटा है, खून के दाग के स्थान पर दिखाई देनी चाहिए जहां एलएन पहले से स्थित था. ध्यान दें कि isotonic समाधान में डूब एलएन. इस साधारण परीक्षण आप को मान्य करने के लिए अनुमति देता है कि आप एक एलएन और नहीं वसा ऊतकों निकाला है.
- सत्यापित करें कि कोई बाल घाव में हैं.
- 2 त्वचा के भागों को एक साथ चिपका (त्वचा के अंदर) और उन्हें एक क्लिप के साथ स्टैपल द्वारा चीरा बंद करें. हम लागू करने के संदंश के साथ कुछ मिशेल क्लिप का उपयोग करें. एक या 2 क्लिप चीरा के आकार पर निर्भर करता है स्थापित करें. ज्यादातर अक्सर, क्लिप गिर जब ऊतक चंगा.
3. पश्चात की देखभाल
- पिंजरे के नीचे करने के लिए कुछ गीला भोजन जोड़ें ताकि चूहों को आसानी से सर्जरी के बाद फ़ीड कर सकते हैं.
- सर्जरी के बाद 6 से 8 घंटे के बारे में, चूहों की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे दर्द का अनुभव नहीं है. ध्यान से (आसन, चाल में उनके व्यवहार का निरीक्षणcongener और फर की उपस्थिति के साथ teraction). यदि चूहों का समग्र रूप में गरीब है, buprenorphine की दूसरी खुराक प्रशासन. अगले दिन तक चूहों को उनके सामान्य व्यवहार अन्यथा हासिल buprenorphine के प्रशासन के लिए जारी रखना चाहिए. चूहों endpoints के पहले से निर्धारित है और अपने पशु देखभाल परिषद द्वारा स्वीकार किए जाते हैं कभी नहीं पहुँचना चाहिए. आप सलाह लेने और अपने जानवरों की देखभाल मछली पालने का बाड़ा तकनीशियन से मदद करना चाहते हो सकता है.
4. लसीका नोड हैंडलिंग
- प्रयोगशाला में, एक एकल कोशिका निलंबन को प्राप्त करने के लिए, के रूप में अपने सामान्य प्रक्रिया के अनुसार एलएन अलग कर देना. हम पाले सेओढ़ लिया स्लाइड के खिलाफ एलएन प्रेस और नियमित रूप से 1-2 एक्स 10 एल एन प्रति 6 कोशिकाओं प्राप्त. वैकल्पिक रूप से, हम शाही सेना निष्कर्षण के लिए एलएन तैयार करते हैं.
- दाग के रूप में अपने सामान्य प्रोटोकॉल के प्रति कोशिकाओं. आप उम्मीद एलएन प्रवाह cytometry प्रोफाइल प्राप्त करना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
आगे और पक्ष बिखराव पी के एक उदाहरणबहुत सर्जरी द्वारा या एक बलिदान माउस (चित्रा 2) से एक anesthetized माउस से काटा LNS के लिए दिखाया गया है. प्रोफ़ाइल और जीना लिम्फोसाइट गेट में कोशिकाओं के प्रतिशत के प्रदर्शन है कि एलएन सर्जरी फसल की कोशिकाओं के लिए एक उपयुक्त तकनीक है वही कर रहे हैं.
चित्रा 1 वंक्षण और माउस में बाहु एलएन स्थानीयकरण. वंक्षण एल एन ए हिंद पंजा बस के ऊपर स्थित है, पेट की ओर से थोड़ा,. बी बाहु एलएन अगली टांग के पीछे स्थित है.
चित्रा लिम्फोसाइटों 2. के प्रवाह cytometry प्रोफ़ाइल एलएन सर्जरी के बाद प्राप्त की. आगे और पक्ष बिखराव प्रोफाइल एक anesth से काटा LNS के लिए दिखाए जाते हैंसर्जरी (ए) के द्वारा या एक बलिदान माउस के (बी) से etized माउस. LNS काटा गया है, अलग और एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण. रहते लिम्फोसाइट गेट में कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया जाता है.
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Discussion
हम एलएन सर्जरी के एक प्रोटोकॉल है जो कई प्रयोगात्मक सिस्टम को लागू कर सकते हैं वर्णन किया है. हालांकि बहुत उपयोगी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या प्रतिरक्षा सेल homeostasis को पालन करने के लिए, इस तकनीक के कुछ सीमाएँ हैं. सबसे पहले, केवल चार LNS काटा जा सकता है. दूसरा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन प्रणालीगत हो सकता है या सतही वंक्षण या बाहु LNS (त्वचा से draining) में होते हैं. अंत में, काटा कोशिकाओं की संख्या एलएन हटाने, एक तकनीकी सीमा जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए योगदान जब पूर्ण सेल नंबर की जरूरत हो सकता है की गुणवत्ता से प्रभावित है. हालांकि, लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिशत, अपने दम पर, प्रासंगिक और सटीक जानकारी विशेष रूप से प्रदान जब एलएन आकार विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के पार भिन्न नहीं कर सकते हैं. सौभाग्य से, एक बार तकनीक अच्छी तरह से, एलएन हटाने सुधार की गुणवत्ता में महारत हासिल है, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रत्येक एलएन में सेल नंबर के लिए अनुमति देता है. हम मानते हैं कि इन कुछ सीमाओं के बावजूद, एलएन सर्जरी अध्ययन करने के लिए कुंजी लाभ प्रदान करता हैप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रगति. सबसे पहले, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया समय के साथ दिया माउस से लगाया जा सकता है, प्रायोगिक रूप में अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल चूहों की संख्या परिवर्तनशीलता को कम. दूसरा, लिम्फोसाइट homeostasis को या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया LNS में होने वाली दीक्षा के रूप में इस तरह की घटनाओं के सीधे अध्ययन किया जा सकता है. एक अन्य प्रमुख लाभ यह है कि अधिक कोशिकाओं से विस्तारित सेल लक्षण वर्णन के लिए अनुमति रक्त से LNS से बरामद किया जा सकता है. इस तकनीक है जीनोटाइपिंग ट्रांसजेनिक चूहों या बी कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज के रूप में LNS के माध्यम से अन्य सेल रहने आबादी या तस्करी का अध्ययन जैसे अन्य प्रयोजनों के लिए उपयुक्त है.
हमारी प्रयोगशाला और अन्य कई वर्षों के लिए किया गया है इस तकनीक का उपयोग और हम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 7-9,12,13 के पाठ्यक्रम पर और प्रतिरक्षा 5-7 homeostasis को पर किसी भी हस्तक्षेप कभी नहीं देखा है. जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों आराम में अनुक्रमिक एलएन सर्जरी और सीडी 4 की प्रतिशत संख्या को प्रभावित नहीं किया + + कोशिकाओं टी 5-7. इसके अलावा, यह भी इन मापदंडों अवशिष्ट LNS में प्रभावित नहीं किया. इसके अलावा, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, सतही एलएन हटाने के टी सेल प्रतिक्रिया और न ही स्मृति टी कोशिकाओं 8,9,12,13 की पीढ़ी के कैनेटीक्स को प्रभावित नहीं किया. इसके अलावा, टी सेल प्रतिक्रिया के पक्ष तुलना द्वारा पक्ष अनुक्रमिक एलएन सर्जरी द्वारा या तो पीछा या बलिदान माउस (अप्रकाशित परिणाम और चित्रा 2) हमारे हाथ में कोई मतभेद नहीं दिखा था. इसलिए, अनुक्रमिक एलएन सर्जरी टी सेल homeostasis और प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Sylvie Lesage और प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सभी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) की कनाडा के संस्थानों से एक अनुदान (एमओपी 77,545) द्वारा समर्थित किया गया. नथाली Labrecque एक FRSQ वरिष्ठ छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है और मेलिस्सा मैथ्यू एक NSERC अलेक्जेंडर ग्राहम बेल कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति प्राप्त.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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