Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales
Summary
Proporcionamos un protocolo para el cultivo de las neuronas del hipocampo altamente purificada de cerebros de ratones prenatales sin el uso de una capa alimentadora de células gliales.
Abstract
Los cultivos primarios de rata y las neuronas del hipocampo de ratón se utilizan ampliamente para revelar los mecanismos celulares en neurobiología. Al aislar y cultivar las neuronas individuales, los investigadores son capaces de analizar las propiedades relacionadas con el tráfico celular, estructura celular y la localización de la proteína individual, utilizando una variedad de técnicas bioquímicas. Los resultados de estos experimentos son críticos para probar las teorías que abordan las bases neurales de la memoria y el aprendizaje. Sin embargo, los resultados inequívocos de estas formas de experimentos se basan en la capacidad de crecer cultivos neuronales con mínima contaminación por otros tipos de células cerebrales. En este protocolo, el uso de los medios de comunicación específicos diseñados para el crecimiento de neuronas y la cuidadosa disección de tejido del hipocampo embrionario para optimizar el crecimiento de las neuronas sanas y reducir al mínimo los tipos de células contaminantes (es decir, los astrocitos). Embrionario tejido del hipocampo de ratón puede ser más difícil de aislar de tejido roedor similar debido al tamaño de la muestra para dissection. Se muestran las técnicas de disección detallada de hipocampo de embriones crías de ratón del día 19 (E19). Una vez que el tejido del hipocampo es aislado, la disociación suave de las células neuronales se logra con una concentración diluida de la tripsina y la disrupción mecánica diseñado para separar las células de tejido conectivo mientras que proporciona el mínimo daño a las células individuales. Una descripción detallada de cómo preparar pipetas para ser utilizado en la interrupción está incluido. Densidades óptimas de planchas se proporcionan para los inmuno-fluorescencia protocolos para maximizar el cultivo de células de éxito. El protocolo proporciona una técnica rápida (aproximadamente 2 horas) y eficiente para el cultivo de células neuronales a partir de tejido del hipocampo del ratón.
Protocol
Discussion
Cultivos de hipocampo se han utilizado en la biología molecular de más de 20 años. Aunque, en principio, cultivos neuronales se pueden hacer de cualquier parte del cerebro, cultivos de hipocampo han demostrado ser el más popular debido a la arquitectura relativamente simple de la población de células nerviosas en el hipocampo 7. Cultivos de hipocampo son típicamente hechos de la última etapa del tejido embrionario. Este tejido es más fácil para disociar y contiene menos células gliales que funciona…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Michael Wooten por su ayuda en la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
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