In vitro målinger af Tracheal Konstriktion anvendelse af mus
Summary
Transgene mus har været yderst nyttig i tilskrive fysiologiske funktion til gener. Som sådan forskning i almindelighed, og funktionelle undersøgelser af luftveje, i særdeleshed har gennemgået en bemærkelsesværdig skift mod murine modeller. Her giver vi protokoller til<em> In vitro</em> Luftrør konstriktionsassays undersøgelser for at evaluere glat muskel-funktion i murine luftvej.
Abstract
Transgene og knockout-mus har stærke værktøjer til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologien af luftvejene 1,2. In vitro tensometry isolerede luftrøret præparater har vist sig at være et nyttigt assay af luftvejenes glatte muskulatur (ASM) kontraktile respons i genetisk modificerede mus. Disse in vitro-luftrør præparater er relativt simple, giver en robust respons, og bevarer begge funktionelle cholinerge nerver og muskel reaktioner, selv efter lange inkubationer.
Luftrør tensometry tilvejebringer også et funktionelt assay til at studere forskellige second messenger signalveje, der påvirker kontraktion af glat muskulatur. Nedgang i trachea medieres primært af parasympatiske, cholinerge nerver, der frigiver acetylcholin på ASM (figur 1). De store ASM acetylcholin receptorer er muskarine M2 og M3, som er G I / O og GQ koblede receptorer, henholdsvis <sup> 3,4,5. M3-receptorer fremkalder kontraktion af kobling til Gq for at aktivere phospholipase C, forøgelse IP3 produktion og IP3-medieret calciumfrigivelse fra sarcoplasmatisk reticulum 3,6,7. M2 / g i / o signalering menes at forøge kontraktioner ved inhibering af adenylatcyclase, der fører til et fald i cAMP-niveauer 5,8,9,10. Disse veje er den såkaldte "farmakologisk kontraktion kobling" af luftvejenes glatte muskulatur 11. Desuden omfatter cholinerge signalering gennem M2-receptorer (og moduleret ved hjælp M3 signalering) veje at depolarisere ASM hvilket aktiverer L-type, spændingsafhængige calciumkanaler (fig. 1) og calciumindstrømning (såkaldt "excitation-kontraktion kobling" ) 4,7. Mere detaljerede anmeldelser på signalveje styrer luftveje konstriktion kan findes 4,12. De ovennævnte veje synes at være konserveret mellem mus og andre arter. Imidlertid muse tracheas adskiller sig fra andre arter in nogle signalveje. Mest fremtrædende er deres mangel på kontraktile respons på histamin og adenosin 13,14, både kendte ASM modulatorer i mennesker og andre arter 5,15.
Her præsenterer protokoller til isolering af murine trachealringe og in vitro måling af deres kontraktile produktion. Inkluderet er beskrivelser af det solgte udstyrs konfiguration, luftrør ring isolation og kontraktile målinger. Eksempler er givet for at fremkalde kontraktioner indirekte ved hjælp af højt kaliumindhold stimulation af nerver og direkte ved depolarisering af ASM muskel til at aktivere spændingsafhængig calciumindstrømning (1. Høj-K +, figur 1). Derudover er fremgangsmåder præsenteret for stimulering af nerver alene ved hjælp af elektrisk felt-stimulering (2. EFS, figur 1) eller til direkte stimulering af ASM muskel ved hjælp af exogent neurotransmitter anvendes til badet (3. Exogent ACH, figur 1). Dette FLExibility og lette fremstilling gør det isolerede trachea ringen model et robust og funktionelt assay for en række signaleringskaskader involveret i luftvejenes glatte muskulatur kontraktion.
Protocol
Discussion
Protokollen præsenteres her tilvejebringer en fysiologisk præparat til at vurdere luftvejene muskelfunktion. Vi plejer at betjene 3-4 organbad præparater samtidigt, dog færdigpakkede systemer er tilgængelige fra en række leverandører, der tillader samtidige målinger af op til 8 præparater (ADlnstruments, Verden finmekaniske Harvard apparat). Vi har anvendt en række krafttransducere og væv organbade med tilsvarende resultater. Imidlertid finder vi, at elektrisk felt stimulation giver nogen variation baseret p?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra Center for Innovation i forebyggelse og behandling af luftvejssygdomme, NINDS tilskud (NS052574), og fra Sandler Program for Asthma Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
