Mediciones in vitro de la constricción de la tráquea Utilizando ratones
Summary
Los ratones transgénicos han sido extremadamente útiles en atribuir la función fisiológica de los genes. Como este tipo de investigación, en general, y los estudios funcionales de las vías respiratorias, en particular, han experimentado un notable cambio hacia modelos murinos. A continuación presentamos los protocolos para<em> In vitro</em> Estudios de la tráquea de constricción para evaluar la función del músculo liso en las vías respiratorias de ratón.
Abstract
Transgénicos y ratones knock-out han sido herramientas poderosas para la investigación de la fisiología y la fisiopatología de las vías respiratorias 1,2. En tensometry in vitro de aislados traqueal preparativos ha demostrado ser una prueba útil de músculo liso bronquial (ASM) la respuesta contráctil en ratones modificados genéticamente. Estas preparaciones in vitro traqueales son relativamente simples, dar una respuesta contundente, y retener a los dos terminaciones nerviosas colinérgicas funcionales y las respuestas musculares, incluso después de incubaciones largas.
Tensometry traqueal también proporciona un ensayo funcional para estudiar una variedad de vías de segundo mensajero de señalización que afectan a la contracción del músculo liso. La contracción de la tráquea está mediado principalmente por los nervios parasimpáticos, los colinérgicos que la liberación de acetilcolina en ASM (Figura 1). Los principales receptores de acetilcolina son ASM muscarínicos M2 y M3, que son G E / S y los receptores acoplados a Gq, respectivamente <sup> 3,4,5. Receptores M3 evocan la contracción por el acoplamiento a Gq para activar la fosfolipasa C, el aumento de la producción de IP3 y el IP3 mediada por la liberación de calcio desde el retículo sarcoplásmico 3,6,7. M2 / G i / o señalización se cree que mejora las contracciones por la inhibición de la adenilato ciclasa que conduce a una disminución en los niveles de AMPc 5,8,9,10. Estas vías constituyen el llamado "fármaco-contracción de acoplamiento" de músculo liso bronquial 11. Además, la señalización a través de receptores colinérgicos M2 (y modulada por M3 señalización) implica vías que despolarizan la ASM que a su vez activar tipo L, dependientes de voltaje canales de calcio (Figura 1) y el influjo de calcio (llamado "acoplamiento excitación-contracción" ) 4,7. Revisiones más detalladas sobre las vías de señalización que controlan la constricción vía aérea se puede encontrar 4,12. Las vías superiores parecen ser conservadas entre los ratones y otras especies. Sin embargo, tráqueas de ratón difieren de otras especies in algunas vías de señalización. El más destacado es la falta de respuesta contráctil a la histamina y adenosina 13,14, los moduladores ASM bien conocidas en los seres humanos y otras especies 5,15.
Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento de murinos anillos traqueales y la medición in vitro de su producción contráctil. Se incluyen descripciones de la configuración del equipo, el aislamiento de la tráquea y el anillo de las medidas de contracción. Se dan ejemplos para evocar contracciones indirectamente mediante la estimulación de alta de potasio de los nervios y directamente por despolarización del músculo ASM para activar tensión dependiente de la afluencia de calcio (1. Alto K +, Figura 1). Además, los métodos se presentan para estimulaciones de nervios solamente utilizando la estimulación de campo eléctrico (2. SSC, Figura 1) la estimulación, o para directo de músculo ASM utilizando neurotransmisor exógena aplicada al baño (3. Exógeno ACH, Figura 1). Esta flexibility y facilidad de preparación hace que el modelo aislado tráquea anillo un ensayo robusto y funcional para un número de cascadas de señalización que intervienen en la contracción del músculo liso bronquial.
Protocol
Discussion
El protocolo que aquí se presenta ofrece una preparación fisiológica para evaluar la función muscular vías respiratorias. Por lo general, operan 3-4 preparaciones para el baño de órganos al mismo tiempo, sin embargo, los sistemas de envasados están disponibles en una serie de proveedores que permiten la medición simultánea de hasta 8 preparaciones (ADInstruments, Instrumentos del Mundo de precisión y aparatos de la Universidad de Harvard). Hemos utilizado una serie de transductores de fuerza y ba?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca del Centro para la Innovación en Prevención y Tratamiento de enfermedades de las vías de subvención, el NINDS (NS052574), y del Programa de Sandler para la Investigación del Asma.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
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