במדידות חוץ גופית של היצרות קנה הנשימה באמצעות עכברים
Summary
העכברים הטרנסגניים להיות שימושי מאוד ייחוס תפקיד פיזיולוגי ל הגנים. כמו מחקר, כגון בכלל, מחקרים תפקודיות של דרכי הנשימה, במיוחד, עברו שינוי מדהים לכיוון מודלים Murine. כאן אנו מספקים פרוטוקולים<em> במבחנה</em> מחקרים קנה הנשימה התכווצות כדי להעריך את תפקוד השריר החלק בדרכי הנשימה murine.
Abstract
מהונדס לבין עכברים בנוקאאוט היו כלים רבי עוצמה לחקר הפיזיולוגיה ו פתופיזיולוגיה של דרכי הנשימה 1,2. ב tensometry חוץ גופית ההכנות לקנה הנשימה מבודדים הוכיחה להיות שימושי assay של השריר החלק בדרכי הנשימה (ASM) בתגובה כויץ בעכברים מהונדסים גנטית. אלה בהכנות חוץ גופית לקנה הנשימה הם פשוטים יחסית, לתת מענה חזקים, ולשמור את שני קצות העצבים הכולינרגית תפקודית ותגובות שרירים, גם לאחר incubations ארוכים.
Tensometry קנה הנשימה מספקת גם assay תפקודית ללמוד מגוון רחב של השני איתות המסלולים שליח המשפיעות על התכווצות של שריר חלק. התכווצות של קנה הנשימה מתווכת בעיקר על ידי, העצבים הפאראסימפתטית כולינרגית המשחררים אצטילכולין על ASM (איור 1). קולטני אצטילכולין ASM הגדולים הם M2 ו M3 muscarinic שהם G I / O ו GQ קולטנים מצמידים, בהתאמה <sup> 3,4,5. רצפטורים M3 לעורר התכווצות ידי צימוד כדי GQ להפעיל phospholipase C, IP3 גידול הייצור IP3 בתיווך לשחרור סידן reticulum sarcoplasmic 3,6,7. M2 / G I / O איתות הוא האמין כדי לשפר את הצירים על ידי עיכוב של cyclase adenylate מובילה לירידה ברמות הסכמי קמפ 5,8,9,10. מסלולים אלה מהווים את מה שנקרא "pharmaco-התכווצות צימוד" של השריר החלק בדרכי הנשימה 11. בנוסף, איתות כולינרגית באמצעות קולטנים מסוג M2 (ו מווסתת על ידי איתות M3) כוללת מסלולים depolarize ASM אשר בתורו להפעיל מסוג L, מתח תלויי תעלות סידן (איור 1) ואת זרימת סידן (מה שנקרא "עירור-התכווצות צימוד" ) 4,7. סקירות מפורטות יותר על איתות המסלולים השליטה היצרות דרכי הנשימה ניתן למצוא 4,12. המסלולים הנ"ל נראה כי שימור בין עכברים ומינים אחרים. עם זאת, וקנה הנשימה עכבר שונים מינים אחרים אניn חלק איתות המסלולים. הבולט ביותר הוא חוסר התגובה כויץ ל 13,14 ו היסטמין אדנוזין, שניהם ידועים מאפננים ASM בבני אדם ומינים אחרים 5,15.
כאן אנו מציגים פרוטוקולים הבידוד של טבעות לקנה הנשימה של Murine ואת במדידה חוץ גופית התפוקה כויץ שלהם. כללו תיאורים של תצורת ציוד, בידוד קנה הנשימה טבעת ומדידות ההתכווצות. דוגמאות ניתנות לעורר התכווצויות בעקיפין באמצעות גירוי אשלגן גבוהה של עצבים ישירות על ידי שלילת קוטביות של שריר ASM להפעיל מתח תלוי זרם סידן (1. גבוהה K +, איור 1). בנוסף, שיטות מוצגים גירויים של העצבים לבד באמצעות גירוי שדה חשמלי (2. EFS, איור 1), או גירוי ישיר של השריר ASM באמצעות מוליך עצבי אקסוגני להחיל אמבטיה (3. אקסוגני אח, איור 1). זה flexibility וקלות ההכנה הופך את המודל טבעת מבודדת קנה הנשימה assay חזק ומתפקד במשך מספר איתות מפלי המעורבים התכווצות שרירים דרכי הנשימה חלקה.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מספק הכנה פיזיולוגית להערכת תפקוד דרכי הנשימה השריר. אנו פועלים בדרך כלל 3-4 אמבטיה ההכנות איברים בו זמנית, לעומת זאת, מערכות ארוזים מראש זמינים ממספר ספקים המאפשרים מדידה בו זמנית של עד 8 ההכנות (ADInstruments, דיוק מכשירים בעולם, ומכשירים הרווארד). ניצלנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם המרכז לחקר חדשנות מניעה וטיפול במחלות דרכי הנשימה, NINDS מענק (NS052574), ומתוך התוכנית סנדלר לחקר אסטמה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Analogue-Digital Converter | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Heating Circulator | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Isometric Force Transducer | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimulator | Grass Technologies | S88 Dual Output Square Pulse Stimulator | |
| Tissue Bath | WPI | 47264 |
References
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
- Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
- Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Ehlert, F. J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).
- Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
- Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
- Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
- Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).
- Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
- Garssen, J., Loveren, H. V. a. n., Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
- Vass, G., Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
- Borchers, M. T. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).
- Sausbier, M. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
- Scheerens, H. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
- Kenakin, T. P. . A pharmacology primer : theory, applications, and methods. , (2009).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol. , 1803-1817 (2011).
- Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
- Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).
- Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).
- Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).
- Krane, C. M. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).
- Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).
- Fortner, C. N., Breyer, R. M. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).
- Hay, D. W. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).
- Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).
- Trevisani, M. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).
- Mehats, C. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).
- Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. The “classical” ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).
