Les mesures in vitro de constriction trachéale l'aide de souris

Summary

Les souris transgéniques ont été extrêmement utiles en attribuant la fonction physiologique des gènes. En tant que tel, la recherche en général, et les études fonctionnelles des voies respiratoires, en particulier, ont subi un changement remarquable vers des modèles murins. Ici, nous fournir des protocoles pour<em> In vitro</em> Les études de constriction trachée pour évaluer la fonction du muscle lisse des voies aériennes murin.

Abstract

Transgéniques et des souris knock-out ont été des outils puissants pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie des voies aériennes ^1,2. Dans tensometry in vitro de préparations de trachées isolées s'est avéré être un test utile des voies respiratoires des muscles lisses (ASM) la réponse contractile des souris génétiquement modifiées. Ces préparations in vitro trachéaux sont relativement simples, une réponse énergique, et de conserver les deux fonctionnelles terminaisons nerveuses cholinergiques et les réponses musculaires, même après de longues incubations.

Tensometry trachéale fournit également une analyse fonctionnelle pour étudier une variété de voies de signalisation deuxième messager qui affectent la contraction du muscle lisse. Contraction dans la trachée est principalement médiée par les nerfs cholinergiques parasympathiques, qui libèrent l'acétylcholine sur l'ASM (Figure 1). Les principaux récepteurs acétylcholine muscariniques ASM sont M2 et M3, qui sont G _{i / o} et Gq récepteurs couplés, respectivement <sup> 3,4,5. Récepteurs M3 évoquent la contraction par couplage à Gq pour activer la phospholipase C, augmentation IP3 production et la libération de calcium IP3-médiation de l'réticulum sarcoplasmique ^3,6,7. M2 / G _{i / o} de signalisation est censé améliorer les contractions par l'inhibition de l'adénylate cyclase entraînant une baisse des taux d'AMPc ^5,8,9,10. Ces voies constituent ce qu'on appelle le «pharmaco-contraction coupling" des voies respiratoires du muscle lisse ^11. En outre, la signalisation par les récepteurs cholinergiques m2 (et modulée par M3 de signalisation) implique que les voies de dépolariser les ASM qui activent à leur tour de type L, les canaux calciques voltage-dépendants (Figure 1) et de l'afflux de calcium (ce qu'on appelle «couplage excitation-contraction" ) ^4,7. Des études plus détaillées sur les voies de signalisation contrôlant la constriction des voies respiratoires peut être trouvé ^4,12. Les voies ci-dessus semblent être conservée entre la souris et d'autres espèces. Toutefois, trachées de souris diffèrent des autres espèces in quelques voies de signalisation. La plus importante est leur manque de réponse contractile à l'histamine et adénosine ^13,14, deux modulateurs connus ASM chez les humains et autres espèces ^5,15.

Nous présentons ici des protocoles pour l'isolement des anneaux de la trachée et murins les mesures in vitro de leur production contractile. Des descriptions de la configuration de l'équipement, l'isolement anneau de la trachée et des mesures contractiles. Des exemples sont donnés pour évoquer les contractions indirectement en utilisant la stimulation haute de potassium de nerfs et directement par la dépolarisation du muscle ASM pour activer l'influx de calcium voltage-dépendants (1. Haute K ^+, figure 1). En outre, les méthodes sont présentées pour des stimulations de nerfs seules à l'aide une stimulation de champ électrique (2. EFS, figure 1) la stimulation, ou de dommage direct du muscle ASM en utilisant un neurotransmetteur exogène appliquée au bain (3. Exogène ACH, figure 1). Cette flexibilité et la facilité de préparation rend le modèle de bague isolée trachée un dosage solide et fonctionnelle pour un certain nombre de cascades de signalisation impliquées dans la contraction du muscle lisse des voies aériennes.

Protocol

1. Équipement Les principaux composants d'un dispositif de mesure de contraction sont représentés schématiquement à la figure 2A). Un bain de tissu. Le bain de tissu maintient une solution physiologique oxygéné à l'eau tiède. Pour les anneaux de trachée de souris, nous utilisons un bain de 10 ml de tissu qui contient une chemise d'eau pour faire circuler une solution réchauffement, une entrée en verre fritté à l'oxyg?…

Discussion

Le protocole présenté ici fournit une préparation physiologique pour évaluer la fonction musculaire des voies respiratoires. Nous fonctionnent généralement 3-4 préparations pour le bain d'organes en même temps, cependant, les systèmes préemballés sont disponibles à partir d'un certain nombre de fournisseurs qui permettent des mesures simultanées de jusqu'à 8 préparations (ADInstruments, instruments de précision du monde, et Harvard Apparatus). Nous avons utilisé un certain nombre de capteurs…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Analogue-Digital Converter	ADInstruments	PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride)	Sigma-Aldrich	C4832	10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C)
Charting Software	ADInstrtuments	LabChart
Heating Circulator	Haake	Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer	Kent Scientific	TRN001
Stimulator	Grass Technologies	S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath	WPI	47264