Summary
Мы описываем процедуры подготовки и электрофизиологические записи с срезах мозга, которые поддерживают спинно-вентральной оси медиальное энторинальной коры (MEC). Поскольку нейронная кодирования место следующим спинно-вентрально организации в MEC, эти процедуры облегчить исследование клеточных механизмов, важных для навигации и память.
Abstract
Вычисления в мозг опирается на нейроны, отвечающие соответствующим образом их синаптические входы. Нейроны различаются по своим дополнением и распределения мембранных ионных каналов, которые определяют, как они реагируют на синаптические входы. Тем не менее, связь между этими свойств клеток и функции нейронов в себя животным не очень хорошо понял. Один из подходов к этой проблеме является изучение топографически организованные нейронных цепей, в которых положение отдельных нейронов карты на информацию, которую они кодируют или расчеты они проводят 1. Эксперименты с использованием этого подхода предлагают принципы настройки синаптических ответов, лежащих в основе кодирования информации в сенсорных и когнитивных схем 2,3.
Топографической организации пространственных представлений вдоль спинной-вентральной оси медиальное энторинальной коры (MEC) дает возможность устанавливать отношения между клеточных механизмов и расчетов яmportant пространственного познания. Нейроны в слое II от грызунов MEC кодирования местоположения с помощью сетки, как стрельба поля 4-6. Для нейронов спинного найти на позиции в MEC расстояние между отдельными полями стрельбы, которые образуют сеть составляет порядка 30 см, тогда как для нейронов в вентральной все более и более позиций это расстояние увеличивается до более чем 1 метр. Несколько исследований показали, свойств клеток нейронов в слое II из MEC, что, как расстояние между сеткой стрельбы поля, также различаются в зависимости от их спины-вентральной позиции, полагая, что эти сотовые свойства важны для вычисления пространственных 2,7-10.
Здесь мы опишем процедуры подготовки и электрофизиологические записи с срезах мозга, которые поддерживают спинно-вентрально степени MEC позволяет исследование топографической организации биофизических и анатомические свойства MEC нейронов. Спинно-вентральной позиции выявленных п.eurons относительно анатомических ориентиров трудно установить точно с протоколами, которые используют горизонтальные кусочки MEC 7,8,11,12, как это трудно установить ориентиры для точного спинно-вентрально место среза. Процедуры описываются позволяют точного и последовательного измерения расположения записал клеток вдоль спинной-вентральной оси MEC, а также визуализации молекулярных градиентов 2,10. Процедуры были разработаны для использования с взрослой мыши (> 28 дней) и успешно работает на мышах до 1,5 лет. С коррективы они могут быть использованы с младшими мышей или других видов грызунов. Стандартизированной системы подготовки и оценки будет способствовать систематическое исследование клеточного и микросхемы свойства этой области.
Protocol
1. Парасагиттальных Подготовка Slice
1,1 Проанализируйте из полушарий
Все эксперименты на животных должны следовать местным этической экспертизы и национальными правилами. В случае экспериментов, описанных здесь, работа соответствует Соединенное Королевство животных (Научно процедуры) Закона 1986 года. Мы регулярно использовать шейки дислокации без наркоза, чтобы усыпить мышь перед снятием головного мозга. В качестве альтернативы мыши может быть смертельно под наркозом, но в этом случае может быть необходимо для определения выбора анестетика влияет на свойства нейронов.
Удалите из мозга мышей и сразу же место в холодную (4-8 ° C) резка искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) (см. таблицу 1 для решения композиций) клокотало к насыщению карбогена (95% O 2, 5% CO 2).
После более трех минут, осторожно удалить из мозга сutting ACSF с помощью шпателя и аккуратно поместить его в вертикальном положении (спинной стороной вверх) на фильтровальной бумаге, смоченной с режущим ACSF (рис. 1А).
Для облегчения точной установки полушарий, использование бритвы или скальпеля, чтобы удалить как можно больше мозжечка возможно без ущерба для MEC (расположенный в хвостовой крайне головного мозга) и снимите ростральной трети мозга по секционирования во фронтальной плоскости (рис. 1б).
Hemisect мозга, заботясь о том, что раздел именно по вертикальной плоскости от средней линии (рис. 1в).
Вернуться к полушариям пузырилась резки ACSF за полторы минуты.
1,2 Установите полушарий на vibratome
Перед установкой убедитесь, что передний край лопасти vibratome под углом в 20 градусов от горизонтальной ( Осторожно, чтобы свести к минимуму физическое воздействие, удалить каждом полушарии от режущего ACSF с помощью шпателя и положение так, чтобы его медиальной поверхности лежит на шпатель и спинной степени обращено в сторону микротома лезвия. Аккуратно вставьте каждом полушарии на полосу суперклея, заботясь, чтобы убедиться, что медиальной поверхности каждого полушария параллельно микротома базы. Мы обнаружили, что для достижения наилучших результатов спинной поверхности каждого полушария должны быть параллельны и сталкиваются с лезвием vibratome (рис. 1D). 1,3 Обеспечение подготовки во время нарезки После установки сразу же погрузиться полушарий в холодной резки ACSF (4 - 8 ° C). Поддержание температурногоэлектронной и карбогена насыщение всей процедуры нарезки. Если прямое охлаждение и пузырей решения в камеру дробления не практично, периодически пополнять резки решение ACSF в камере со свежим охлажденным и клокотало решение. 1,4 Cut разделы Использование vibratome, удалить кору в обоих полушариях в сагиттальной плоскости до выявления боковой наибольшей степени от MEC (обычно ~ 1 мм вниз от боковой поверхности) (рис. 1F). Между сокращений поднять vibratome лезвие до ~ 200 мкм, чтобы избежать перетаскивания лезвие снова и повреждения ткани подвергаются. Одновременно сократить 400 мкм парасагиттальных разделов в обоих полушариях (если они выстраиваются, как показано на рисунке 1D они оба будут резать в то же время) до медиальной степени MEC будет достигнута. Это можно определить по отсутствию толстой белой полосы вокруг вентро-хвостовой кривой тОн гиппокамп (внешний капсула), невыпуклые формы его ростральной границе и угловой спинно-хвостовых уголок. Рисунок иллюстрирует 1E круговой вид гиппокампа в парасагиттальных самолет сбоку от MEC. Цифры 1F-G иллюстрации как разделы в MEC появляться на различных боковой медиальной позиции, когда нарезка. Обратите внимание на все более бобовидные появление гиппокампа в более медиальной позиции. Каждое полушарие обычно дает два или три 400 мкм ломтиками содержащие MEC. Инкубируйте 1,5 ломтика После каждого удара сразу поместить кусочки в карбогена насыщенной стандартной ACSF поддерживается на водяной бане при температуре 35 ° C. Позвольте кусочки для инкубации при температуре 35 ° C в течение примерно 15 минут в ACSF после нарезки завершена. Удалите часть держателя с водяной бани и продолжать кипит карбогена при комнатной температуре в лвосток 45 минут. 2. Пример парасагиттальных фрагмент эксперимент Типичный эксперимент с использованием этого препарата, чтобы сделать электрофизиологических записей из звездчатых клеток в слое II от MEC. 2,1 оптика оптимизация Перед началом записи убедитесь, что конденсатор находится в центре внимания на кусок плоскости (Келер освещенности) и по центру под большим увеличением (например, 40x) цели. 2.2 Определите клетки интерес Используйте малом увеличении (например, 4х) цель определить примерный район записи в MEC (рис. 2A-B). Переключитесь на высокую цель увеличения определить жизнеспособные клетки в этом регионе (рис. 2C-D). Например, предполагаемый уровень II звездчатые клетки визуально определить их полигональной или яйцевидной формы и несколько первичных дендритов с аналогичным диаметратер, и отсутствие единого большого диаметра апикального дендрита 2,13,14. Они надежно определены на краю Layer I / II границу, где они имеются в изобилии и часто появляются в небольших группах 2,9 (рис. 2C-D). Другие типы клеток, такие как интернейронов и пирамидных клеток также должны быть идентифицированы. На данный момент эксперименты можно проводить, например, с помощью целых клеток патч-зажим для записи потенциал мембраны или мембраны ток определили нейронов, а также электрические или optogenetic методы активации синаптических входов записано нейрона. Нейрон личности могут быть проверены с электрофизиологических свойств нейронов записаны и в том числе флуоресцентные метки в внутриклеточных решение. 3. Измерьте расположение вдоль дорзо-вентральной оси 3,1 Расположение изображения интересов и окружающих кусок Чтобы определить положение RecorDED нейронов вдоль спинной-вентральной оси, сначала использовать низкие цели увеличения к изображению MEC области среза и прилегающих районов. Отметьте расположение интерес, например, в том числе записи электрода в изображении (рис. 3А), либо уйти в отставку диафрагмы поля ириса, чтобы оставить яркий круг вокруг места интереса копию изображения. Чтобы определить местоположение записи в дубликат изображения могут быть наложены на исходное изображение от места регистрации и его окрестности (рис. 3В). До 3-х отдельных малом увеличении (4x) изображения могут быть необходимы для покрытия территории от вентральной расположение записи на спинной границе MEC. Эти изображения могут быть сшиты вместе, используя изображение манипуляции ПО для обеспечения изображения, измерения расстояния могут быть взяты из (рис. 3). Дальнейшая проверка нейрон личность и местонахождение может быть осуществлено после регистрации путем включениянеактивных маркеров, таких как biocytin или Alexa красителей в внутриклеточный раствор и затем с помощью соответствующей обработки тканей после регистрации 2. 3.2 Создать спинной границе MEC Спинной границе MEC обеспечивает удобный ориентир, из которых для измерения спинно-вентральной позиции. Вентральной границы MEC не так хорошо определены. На рисунке 4 показано, как MEC сотовой ориентиры определены в Ниссля окрашенных кусочков в различных средне-боковой позиции появляются в ДВС освещения. На рисунке 4 показана круговая гиппокампе (рис. 4 (г)) и отсутствие parasubicular выступ в слое I (рис. 4 (IV)), связанные с парасагиттальных ломтиками содержащие боковые энторинальной коры (LEC). Рисунок 4 г. до н.э. типичные кусочки, которые содержат MEС. спинной части известного темного спинной энторинальной / Parasubicular границы региона в ОПК освещенных ломтиками содержит область parasubiculum. Площадь parasubiculum четко выявлены Ниссля окрашивания в соответствующие изображения в колонке (III). Спинной границе MEC (черные стрелки в 4B и 4C колонка (IV)) является вентральной к группе parasubicular клеток, выступает далеко в слое I (красные стрелки на 4B и 4C колонке (IV)). Сравнение рисунков 4B и 4C столбцов (II) и (III) показывают, что спинной границе MEC в Ниссля разделов соответствует месте, вентральный к спинному краю темного энторинальной / Parasubicular границы региона в ДВС часть ( черные стрелки). Расположение границы можно оценить из DIC изображений и сравнение с эталонными изображениями (см. также. 14). Будущие проверки спинного MEC границе с молекулярными маркерами позволит повысить точность этой оценки. Отметим тхат окрашивали ссылкой разделы и разделы, которые обрабатываются для выявления морфологических меченых нейронов, могут быть подвержены значительным сжатием. Сравнение абсолютных расстояний относительно ориентиров развития ДВС-синдрома и справочные разделы Поэтому в первую очередь требует измерения и коррекции усадки (см., например, 2). 3,3 калибровку и измерения расстояний Для облегчения измерения расстояния изображения, использовать тот же самый низкий целью увеличения изображения на координатной сетки установить пиксель: отношение расстояния преобразования. Измерьте расстояние от пикселя спинной границе MEC к месту интереса по контуру MEC помощью графической программы и конвертировать пикселей расстояние до расстояния в мкм (рис. 5а). Если нейроны заполнены маркер, таких как biocytin, то расположение записанных нейрон может также быть восстановлены соответствующей обработки (см., например, 2). 4. ReprРезультаты esentative Рисунок 5А показан пример малом увеличении (4x) составного изображения парасагиттальных часть после записи с места записанного нейронов и измерения направляющих накладывается. Записи из отмеченных спинной и брюшной клеток звездчатого показаны на рисунке 5B. Эти записи помогут установить личность клетки и показать, как электрические свойства MEC слой клеток звездчатого II отличаются на спинной и брюшной местах. 
Рисунок 1. Подготовка парасагиттальных ломтиками. Всего мозг отдыхает с спинной стороной вверх на фильтровальную бумагу, смоченную резки ACSF. B
Рисунок 2. Определение MEC слой II клеток под ДВС освещения. Пример составного изображения пункт сагиттальный срез мозга при малом увеличении (4x). Отдельные изображения были выровнены и смешивается для удаления отвлекающих краях и виньетирование. Важной вехой областях ч: гиппокамп, м:. MEC B урожая от отдельных малом увеличении (4x) изображение, которое содержит слой II в MEC, видны как темные вертикальные полосы у правого края рука C MEC слой II при большом увеличении (. 40x) с ДВС освещения. Изображение выравнивается и смешивать композиции нескольких изображений. Плотных центральных "столбца ячеек Layer II. D Одноместный большим увеличением DIC изображение, показывающее группе здоровых клеток предполагаемого звездчатые и интернейронов в слое II. Как показано здесь, звездчатые клетки часто встречаются группами на границе слоев I / II. Пирамидальные клетки, как правило, находятся ближе к Layer II / III границу. Пунктирные очертания переменного тока указывают на степень BD соответственно. Масштаб бары: в А и В 500 мкм, в C и D 100 мкм.
Рисунок 3 "SRC =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Измерение спинно-вентральной позиции пунктов, представляющих интерес. Унифицированные малом увеличении (4x) изображений, которые включают в себя весь дорзо-вентральной степени MEC между расположением интерес (отмечен кончик электрода записи) и темно энторинальной / Parasubicular вехой границе области (используется для установления спинной границе в MEC - см. Рисунок 4) B Как и в том числе, но накладывается изображение остановился внизу поле ирисовая диафрагма (обложил со снижением прозрачности) вместо записи электрод для обозначения места интереса..
Рисунок 4. Оценка спинной границе MEC от DIC изображений парасагиттальных ломтиками. AC парасагиттальных разделы (в медиальной боковой) с энторинальной коры. ДВС и Ниссля разделы из разных микрофоновэлектронной AC колонки (я):.. Всего парасагиттальных ломтиками (400 мкм) (выровнены и смешанных композиций малом увеличении (4x) изображения) AC колонка (II): Крупный план энторинальной коры с характерным темно энторинальной / Parasubicular границы региона В верхней части каждого изображения. AC колонка (III) Ниссля окрашенных кусочков (40 мкм) с другой мыши в соответствие с изображениями переменного тока (II). Темный, плотный слой клеток слой II. Сравнение столбцов (II) и (III) показывает, как Ниссля клеток, окрашенных появляется в DIC изображений AC колонка (IV). Деталь Ниссля окрашенных кусочков. В и С, колонка (IV) включают в себя клетки parasubiculum (спинной части темно энторинальной / Parasubicular границы региона в DIC изображений) и клетки спинного MEC. В B (IV) и С (IV) большой участок спинного parasubicular клетки, которая простирается вглубь слоя я хорошо видна (красные стрелки). Нижний край этих патчей соответствует спинной боrder из MEC (черные стрелки). В (IV) parasubicular патч отсутствует, что указывает на кусок слишком боковые для стандартного парасагиттальных MEC подготовки срез. Во всех панелей, черные стрелки указывают на спинной границе MEC. Серые стрелки показывают приблизительный вентральной границы MEC.
Рисунок 5. Представитель результаты. Смешанные и обрезать часть изображения на рисунке 3. Позиции спинной клетки и брюшной клетки обозначены синим и зеленым темные кружки соответственно. Черная стрелка отмечает оценкам спинной границе MEC и распространяется в глубокие слои белой пунктирной линией. Сплошная белая линия руководства показывает контур пути, по которому пикселей измерение расстояния от спинной границе MEC в вентрально расположенные клетки был доставлен. Масштаб по сайту: 500 мкм B Electro.физиологические следы от клеток, указанные в А. Слева направо - подпороговых ответов на текущие действия, используемые для расчета входного сопротивления, пики ответ на большой положительный текущий шаг, шипованные подробно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для облегчения исследования MEC схемы свойства, которые следуют спинно-вентрально организации были описаны здесь подробно процедуру для получения парасагиттальных подготовки кусочек, который сохраняет спинно-вентрально степени MEC.
Критические шаги
Удаление мозга от животных. Будьте особенно осторожны, чтобы избежать давления на мозг. Это важнее, чем быстрое удаление головного мозга.
Нарезки. Фрагмент должны быть прочно приклеены к полу держит камеру. Vibratome должны иметь оси вибрации <2 мкм и должны использоваться с большой амплитудой и низкой скорости. Оптимальные настройки могут отличаться между моделями и должны быть установлены путем проб и ошибок.
Мониторинг решение температурах. Мы считаем, что часть качества зависит от температуры во время и после резки. Outsid е рекомендуется температура колеблется число здоровых нейронов снижается, нейронов может стать более трудным для исправления и ответы на синаптическую вход может быть уменьшена.
Imaging. Келер освещенности и центрирования диафрагмы область диафрагмы важны для визуализации клеток перед записью.
Поиск и устранение неисправностей
Фрагменты содержат мало здоровых клеток. Замените решений. Проверьте оси перемещения на vibratome. Проверьте температуру решений. Проверьте ориентацию срез при резке.
Нейроны в срезе трудно увидеть. Проверьте Келер освещенности правильно настроено. Проверьте микроскопа линзы были чистыми.
Сложность формирования gigaseals. Проверьте форму записи электродов. Изучить часть признаков гибели клеток, например, круглой формы клетки, или клетки высокая контрастность.
ve_content "> Изображения срез трудно выровнять. Убедитесь, что кусочки находятся в фокусе, чтобы захватить максимально подробно. Для автоматического выравнивания изображения> 40% перекрытием изображения, как правило, достаточно.Недостатки
Одним из потенциальных ограничений парасагиттальных подготовки кусочек в том, что очень большие расстояния синаптических связей в MEC не могут работать непосредственно параллельно плоскости парасагиттальных 9, 15 и поэтому не могут быть сохранены. Сохранение этих связей может потребоваться изменение процедуры подготовки, чтобы изменить угол среза сократить либо hemisecting или монтажа полушарий головного мозга на vibratome под углом в ростральной-каудальном плоскости. Аналогичные соображения можно применять для сохранения других соединений, например, афферентные входы от медиальной перегородкой.
Сравнение с горизонтальным MEC препараты часть
- Точное измерение спинно-вентрально место важнодля установления количественных соотношений между положением вдоль на спине-вентральной оси и физиологических свойств. В горизонтальном препаратов кусочек 7,8,11,12 трудно определить точное спинно-вентрально место разреза, и это затрудняет создание последовательного расположения ссылки. В противоположность этому, в подготовке парасагиттальных часть спины границы MEC легко установить в качестве точки отсчета и знания глубине нейронов в часть не является необходимым для оценки его спинной-вентральной позиции. Парасагиттальных ломтиками поэтому значительно облегчит точное измерение спинно-вентрально месте, что позволяет более быстро и точно исследование количественных соотношений между спинным-вентральной расположения и клеточные и схема свойств.
- Молекулярная градиенты имеют важное значение для топографической организации замыкания в MEC и могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной или других методов маркировки. В отличие от горизонтальных срезов, в котором яэлектронного сигнала должны быть сопоставлены между кусочками в разных спинно-вентрально местах, парасагиттальных подготовка позволяет легче, более мелкими и более надежной визуализации и количественной оценки спинно-вентрально молекулярной градиентов.
- . Спинной-вентральной градиентов в синаптические связи могут играть важную роль в MEC функции. Парасагиттальных подготовки может сохранить часть синаптических связей между спинной и брюшной области в MEC, что важно для исследования соединений как внутри, так и отличаться между различными местах вдоль спинной-вентральной оси MEC и для поддержания целостности цепи одинаково в разных спинно-вентрально местах. Если подключение изменяется существенно вдоль спинной-вентральной оси горизонтальных срезов, менее вероятно, в равной степени включает полные функциональные микросхемы на каждой крайности.
Перспективы развития и применения
Знание молекулярных детерминантклеточных идентичности в MEC позволит окончательный характеристики нейронов личности и дают возможность более точного определения спинно-вентрально месте.
Использование парасагиттальных подготовки ломтик, топографически организованные реакции клеточного типа и местоположения удельной активности нескольких нейронов могут наблюдаться одновременно (например, с помощью напряжения чувствительной красителей или кальция изображениями) в течение одного среза.
В сочетании с инструментами optogenetic, парасагиттальных подготовка позволяет селективной активации в разных местах вдоль спинной-вентральной оси. Запрашиваемая как микросхемы в различных спинно-вентрально местах реагирует на пространственно целевой активации может предоставить важную информацию о MEC функции микросхемы.
Мы ожидаем, что этот препарат обеспечит простой, надежный и стандартизированной основе исследования спинно-вентрально градиентов в физиологических свойств и облегченияпонимание того, как эти градиенты вклад в обработку информации свойства MEC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ничего не раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарность за их поддержку: Комиссия по стипендиям Содружества Великобритании финансирования (HP), EPSRC (HP), СИББН (РНБ) и Европейского Союза Марии Кюри (РНБ).
References
- O'Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
- Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O'Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
- Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
- Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -B.
- Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
- Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
- Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
- Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
- Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
- Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
- Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
- van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
- Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).
