Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer
Summary
We tonen FRET tussen geconjugeerde polymeer polydiacetylene (PDA) en fluorofoor aan het oppervlak van liposomen PDA voor de detectie van biomoleculen. PDA liposomen bevatte receptor moleculen op hun oppervlak voor biomoleculen te worden gebruikt als probes. Ligand-receptor interacties leiden tot veranderingen in de FRET efficiency tussen de fluorofoor en PDA die de basis van de meetmechanismes.
Abstract
FRET is een proces waarbij energie niet radiatief overgebracht van een opgewonden donormolecuul een grondtoestand acceptor molecuul door lange afstand dipool-dipool interacties 1. In de onderhavige detectie assay, we gebruiken een interessante eigenschap van PDA: blauw-verschuiving van de UV-Vis-absorptiespectrum van elektronische PDA (figuur 1) na een analyt met receptoren aan PDA 2,3,4,7. Deze verschuiving in de PDA absorptiespectrum bepaald veranderingen in de spectrale overlap (J) tussen PDA (acceptor) en rhodamine (donor) die leidt tot veranderingen in de FRET efficiency. Aldus worden de interacties tussen analyt (ligand) en receptoren gedetecteerd door FRET tussen donorfluoroforen en PDA. In het bijzonder tonen we de detectie van een modeleiwit molecule streptavidine. We tonen ook de covalente binding-runderserumalbumine (BSA) het liposoomoppervlak met FRET-mechanisme. Deze interacties tussen thij dubbelgelaagde liposomen en eiwitmoleculen kunnen worden waargenomen in real-time. De voorgestelde methode is een algemene methode voor het detecteren van kleine chemische en biochemische grote moleculen. Aangezien fluorescentie intrinsiek gevoeliger dan colorimetrie, kan de detectielimiet van de bepaling in sub-nanomolaire gebied of lager 8. Verder PDA kan fungeren als een universele acceptor in FRET, waardoor meerdere sensoren kunnen worden ontwikkeld met PDA (acceptor) gefunctionaliseerd met donors en verschillende receptoren gehecht aan het oppervlak van liposomen PDA.
Protocol
Discussion
Wij hebben selectieve binding van lysinerest van eiwit op liposoomoppervlak met NHS-amine reactie. Deze FRET gebaseerde methode in staat is van het doen van Real-time monitoring van biotine-streptavidine binding en eiwitten (BSA) binding aan het liposoom oppervlak. Soortgelijke procedure kan worden toegepast om de binding van verschillende dynamiek eiwit interacties met hun selectieve receotiren. Er flexibiliteit in het kiezen van fluoroforen die zullen veranderingen in de J waarden afhankelijk van de spectrale…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door de National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) en ORDA op SIUC. Wij danken NSF voor een subsidie (CHE-0959568) voor de aankoop van een FE-SEM. We willen graag prof. Matthew McCarroll bedanken voor nuttige discussies. Julia Reyes zal graag COLCIENCIAS, Colombiaanse Agentschap en Universidad Pedagogica y Tecnológica de Colombia bedanken voor haar beurs en financiële steun.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
