Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy
Summary
Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.
Abstract
FRET è un processo in cui l'energia non è radiativamente trasferita da una molecola donatrice eccitato ad un stato fondamentale molecola accettore a lungo raggio attraverso interazioni dipolo-dipolo 1. Nel saggio di rilevamento presente, utilizziamo una proprietà interessante di PDA: blu-shift in UV-Vis spettro di assorbimento elettronica PDA (figura 1) dopo un analita interagisce con i recettori collegati al PDA 2,3,4,7. Questo spostamento nello spettro di assorbimento PDA fornisce cambiamenti nelle sovrapposizione spettrale (J) tra PDA (accettore) e rodamina (donatore) che porta a variazioni del FRET efficienza. Pertanto, le interazioni tra analita (ligando) e recettori vengono rilevati tramite FRET tra fluorofori donatori e PDA. In particolare, ci mostra il rilevamento di un modello di streptavidina molecola proteica. Abbiamo inoltre dimostrato il legame covalente-di albumina di siero bovino (BSA) alla superficie del liposoma con FRET meccanismo. Queste interazioni tra tegli liposomi bistrato e molecole proteiche possono essere rilevati in tempo reale. Il metodo proposto è un metodo generale per il rilevamento chimico piccole e grandi molecole biochimiche. Poiché fluorescenza è intrinsecamente più sensibile colorimetria, il limite di rilevazione del test può essere in sub-nanomolare gamma o inferiore 8. Inoltre, PDA può agire come accettore universale FRET, il che significa che più sensori possono essere sviluppati con PDA (accettore) funzionalizzato con donatori e recettori diversi attribuiti sulla superficie dei liposomi PDA.
Protocol
Discussion
Abbiamo effettuato legame selettivo di residuo di lisina della proteina sulla superficie del liposoma con NHS-ammina reazione. Questo metodo basato FRET è capace di fare monitoraggio in tempo reale di biotina-streptavidina vincolanti e proteine (BSA) di legame alla superficie del liposoma. Analoga procedura può essere applicata per studiare la dinamica di legame di proteina diversi con i loro recettori selettivi. C'è flessibilità nella scelta fluorofori che forniranno cambiamenti nei valori J seco…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito attraverso la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) e ORDA a SIUC. Ringraziamo NSF per una borsa di studio (CHE-0959568) per l'acquisto di un FE-SEM. Vorremmo ringraziare il Prof. Matteo McCarroll per le discussioni utili. Julia Reyes si ringraziare Colciencias, Agenzia colombiano e Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia per la sua borsa di studio e sostegno finanziario.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
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