Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer
Summary
Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.
Abstract
FRET ist ein Prozess, bei dem Energie ist nicht strahlend von einem angeregten Donor-Molekül zu einem Grundzustand Akzeptor Molekül übertragen über weitreichende Dipol-Dipol-Wechselwirkungen ein. Im vorliegenden Abfühlen Assay, verwenden wir eine interessante Eigenschaft der PDA: Blauverschiebung im UV-Vis elektronischen Absorptionsspektrum PDA (Abbildung 1), nachdem ein Analyt wechselwirkt mit Rezeptoren an PDA 2,3,4,7. Diese Verschiebung in der PDA-Absorptionsspektrum liefert Änderungen der spektralen Überlappung (J) zwischen PDA (Akzeptor) und Rhodamin (Donor), die auf Änderungen in der FRET-Wirkungsgrad führt. Somit werden die Wechselwirkungen zwischen Analyt (Ligand) und Rezeptoren durch FRET zwischen Donor-Fluorophore und PDA detektiert. Insbesondere zeigen wir, das Erfassen eines Modells Proteinmolekül Streptavidin. Darüber hinaus zeigt die kovalente Bindung von-Rinderserumalbumin (BSA) an der Oberfläche der Liposomen mit Mechanismus FRET. Diese Wechselwirkungen zwischen ter Doppelschicht Liposomen und Proteinmoleküle können in Echtzeit erfasst werden kann. Das vorgeschlagene Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zum Erfassen kleinen chemischen und biochemischen großen Molekülen. Da Fluoreszenz ist intrinsisch empfindlicher als Farbmessung, kann die Nachweisgrenze des Assays in sub-nanomolaren Bereich oder unteren 8 sein. Weitere, PDA als universelle Akzeptor in FRET zu handeln, was bedeutet, dass mehrere Sensoren mit PDA (Akzeptor) mit Gebern und verschiedene Rezeptoren auf der Oberfläche der PDA Liposomen befestigt funktionalisiert entwickelt werden können.
Protocol
Discussion
Wir haben eine selektive Bindung der Lysinrest von Protein auf Liposomenoberfläche unter Verwendung NHS-Amin-Umsetzungsprodukte. Diese FRET basierten Methode ist dazu in der Lage Echtzeit-Überwachung von Biotin-Streptavidin-Bindung und Protein (BSA) Bindung an der Oberfläche der Liposomen. Ähnliches Verfahren angewendet werden, um die Bindungseigenschaften Dynamik der verschiedenen Protein-Wechselwirkungen mit ihrer selektiven Rezeptoren zu untersuchen. Es gibt Flexibilität bei der Auswahl Fluorophore, die Änderun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materialwirtschaft Technology Center (MTC) und ORDA am SIUC vorgesehen. Wir danken NSF für ein Stipendium (CHE-0959568) für den Kauf eines FE-SEM. Wir möchten Prof. Matthew McCarroll für hilfreiche Diskussionen danken. Julia Reyes wird gerne COLCIENCIAS, kolumbianische Agentur und Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia für ihre Stipendien und finanzieller Unterstützung danken.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
