Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência
Summary
Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.
Abstract
FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.
Protocol
Discussion
Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C., New, R. R. C. . Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
