Hydrofobe Salt gemodificeerde Nafion voor enzym immobilisatie en stabilisatie

Summary

Dit artikel beschrijft de procedure voor het synthetiseren een hydrofobisch gemodificeerd Nafion enzym immobilisatie membraan en hoe eiwitten en / of enzymen te immobiliseren in de membraan en testen hun specifieke activiteit.

Abstract

In de afgelopen tien jaar is er een schat aan aanvraag voor geïmmobiliseerde enzymen en gestabiliseerd inclusief biokatalyse, biosensoren, en biobrandstof cellen. ^1-3 In de meeste bioelectrochemical toepassingen worden enzymen of organellen geïmmobiliseerd op een elektrode-oppervlak met het gebruik van een soort van polymeermatrix. Dit polymeer steiger te houden enzymen stabiel zijn voor de gemakkelijke diffusie van moleculen en ionen in en uit de matrix. De polymeren die voor dit type immobilisatie gebaseerd op polyaminen of polyalcoholen - polymeren die de natuurlijke omgeving van de enzymen die Zij bevatten en stabiliseren het enzym door waterstof of ionische bindingskracht nabootsen. Een andere methode voor het stabiliseren enzymen is het gebruik van micellen die hydrofobe gebieden die ingekapseld en stabiliseren enzymen bevatten. ^4,5 name heeft de Minteer groep een micellaire polymeer gebaseerd op commercieel verkrijgbare Nafion. ^6,7 Nafionzelf een micellaire polymeer waarmee het kanaal ondersteunde diffusie van protonen en andere kleine kationen, maar de micellen en kanalen zeer klein en het polymeer is erg zuur door sulfonzuur zijketens die ongunstig is voor enzyme immobilisatie. Wanneer echter Nafion wordt gemengd met een overmaat van het hydrofobe alkyl ammoniumzouten zoals tetrabutylammoniumbromide (TBAB), de quaternaire ammonium kationen vervangen protonen en wordt de tegenionen van de sulfonaatgroepen van het polymeer zijketens (figuur 1). Dit resulteert in grotere micellen en kanalen in het polymeer waarmee de verspreiding van grote substraten en ionen die nodig zijn voor enzymatische functie zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Deze gewijzigde Nafion polymeer werd gebruikt om verschillende soorten enzymen en mitochondriën immobiliseren voor gebruik in biosensoren en biobrandstof cellen. ^8-12 Dit document beschrijft een nieuwe procedure voor deze micellar polymeer enzym immobilisatie membraan dat kan stabiliseren enzymen. De synthese van de micellaire enzym immobilisatie membraan de procedure voor het immobiliseren enzymen in het membraan en de assays voor het bestuderen enzymatische specifieke activiteit van het geïmmobiliseerde enzym worden hieronder beschreven.

Protocol

1. Wijziging van Nafion met quaternaire ammoniumzouten

1. Schud een fles van 5% w / v Nafion opschorting krachtig gedurende ca. 30 seconden dat Nafion zorgen gelijkmatig gesuspendeerd in oplossing.
2. Pipetteer uit 2 ml van het nu opnieuw in suspensie Nafion in een glazen flesje (flacon volume zou kunnen bevatten van 2,5 ml tot 10 ml).
3. Meet een 3-voudige molaire overmaat (ten opzichte van de sulfonzuurgroepen aan de Nafion polymeer) van de alkyl ammoniumbromide zout (geschikte massa worden weergegeven in tabel 1) en voeg dit de flacon 2 ml Nafion.
4. Vortex de flacon 1500 rpm gedurende 10-15 minuten.
5. Giet de viskeuze oplossing in een plastic lade die met een gewicht van ca. 3 x 3 inch, en gebruik een pipet om eventueel resterende oplossing te brengen van het flesje om het weegvlak.
6. Laat de oplosmiddelen verdampen uit de wegen boot, waardoor een gele / bruine transparante film op de bodem van de weegvlak (Figuur 2). De snelheid van oplosmiddelverdamping moet zodanig zijn dat het meer dan 6 uur voor oplosmiddel verdampt is. Als het oplosmiddel verdampt te snel, zal een witte, knapperige materiaal in plaats de vorm van een transparante film dat aangeeft dat de micellaire structuur van het polymeer is vernietigd, en je moet opnieuw beginnen met de procedure. Als oplosmiddel verdamping te traag is, kan een de-luchtbevochtiger nodig zijn, omdat er te traag van verdamping meestal leidt tot een kleverig, oranje gel en moet u opnieuw opstarten van de procedure. Typische temperatuurbereik voor verdamping van het oplosmiddel zijn 20 - 37 ° C. De feitelijke omstandigheden voor het drogen zijn afhankelijk van de relatieve vochtigheid en temperatuur in de kamer, maar het is belangrijk dat het drogen wordt langzaam micel structuur te handhaven, maar niet te langzaam om voor gelvorming.
7. Vul de wegen boot met 18M Ωcm gedeïoniseerd water (10-20 ml water), dek af en laat het inwerken 12-24 uur om het teveel aan alkyl ammoniumbromide zouten en HBr verwijderen.
8. Laat de weegvlak zitten ontdekt tot het polymeer volledig droog Op dit punt dient het polymeer een duidelijke en enigszins bros folie. Ook als de lucht zeer vochtig, kan ontvochtigingstoestel nodig om de verdamping tijdig vullen.
9. Met behulp van een spatel, verwijder voorzichtig de gedroogde film van de weeg-lade en breng deze in een schone glazen flacon.
10. Voeg 2 ml ethanol en 3 keramische mengen kralen en vortex 4 uren of totdat de polymeerfilm volledig geresuspendeerd.

2. Immobilisatie van enzymen in TBAB-Modified Nafion voor de activiteit Assays

1. Voor droge enzym weeg 1-10 mg van het enzym in een 1,5 ml microcentrifugebuisje en 1 ml 100 mM pH 7 fosfaatbuffer een 1-10 mg / ml enzym oplossing. For een enzym dat in oplossing gebruiken bicinchoninic zuur (BCA) assay ¹³ de hoeveelheid eiwit bepalen en voeg een geschikte hoeveelheid van 100 mM fosfaatbuffer het eiwit-concentratie aan 1-10 mg / ml. 1-10 mg / ml komt in principe overeen 1-50 nanomoles / ml.
2. 120 pi van 1 mg / ml enzymoplossing, wordt 60 ul van de alkylammonium-gemodificeerde Nafion oplossing en vortex 10 seconden. (Dit mengsel kan worden opgeschaald voor grote aantallen replica. Houd de enzym-to-polymeeroplossing ratio op 2:1.)
3. Pipetteer 60 pi van het enzym / polymeeroplossing in de bodem van drie aparte 1 ^cm2 cuvetten, en laat een nacht drogen.

3. Analyse van geïmmobiliseerde NAD-afhankelijke dehydrogenase-enzym

1. Om de cuvet toevoegen 1,3 ml 50 mM natriumpyrofosfaat (pH 8,8), 1,5 ml 15 mM NAD (vers bereide) en 0,1 ml water.
2. Plaats de cuvette in een UV / Vis spectrofotometer (dat wil zeggen ThermoScientific Evolution 260 Bio en Thermo Spectronic Genesys 20) ingesteld op een golflengte van 340 nm.
3. Nul de spectrometer, en voeg vervolgens 0,1 ml ethanol. Meng de reagentia door voorzichtig pipetteren de oplossing op en neer 5 keer. Voor een leeg gebruik 0,1 ml van extra water in plaats van 0,1 ml ethanol.
4. Neem de absorptie bij 340 nm na 5 minuten na de reagentia werden toegevoegd aan de cuvet en 20 minuten na. Zet de twee gegevens op een helling kan worden gebruikt voor activiteit berekeningen krijgen.

4. Analyse van geïmmobiliseerde PQQ-afhankelijke dehydrogenases

1. Om de cuvet, voeg 1,5 ml natriumfosfaat (pH 7,3) en 200 pi van 600 pM PMS.
2. Plaats de cuvette in een UV / Vis spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 600 nm, en vervolgens nul de spectrometer.
3. Voeg 100 ul van 700 ul DCIP en 200 pi van het substraat van belang (ethanol, aceetaldehyde, glycerol, glucose of glyceraldehyde), en meng de reagentia door voorzichtig pipetteren de solution op en neer 5 keer. Voor een leeg, 200 pl water in plaats van het substraat van belang.
4. Neem de absorptie bij 600 nm na 5 minuten na de reagentia werden toegevoegd aan de cuvet en 20 minuten na.

5. Analyse van geïmmobiliseerde glucose-oxidase

1. Om de cuvet toevoegen 2,0 ml van een oplossing die 0,2 M p-hydroxybenzoëzuur, 0,02% (w / v) natriumazide, 128 U peroxidase, 0,3 mM 4-aminoantipyrine, 1 M kaliumfosfaat, en 50 mM glucose. Meng de oplossing en neer te pipetteren 5 maal.
2. Plaats de cuvette in een UV / Vis spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 510 nm.
3. Neem de absorptie bij 510 nm na 5 minuten na de reagentia werden toegevoegd aan de cuvet weer 20 minuten na.

6. Representatieve resultaten

De micellaire structuur van de gewijzigde Nafion polymeer kan worden verstoord door het drogen van de oorspronkelijke zout / polymeer co-gegoten film te fast. Figuur 2 toont een zout / polymeermengsel dat gedroogd kunnen resulteert in een transparante, lichtbruine film. Een film die te snel opdroogt kan resulteren in ondoorzichtige witte vlokken polymeer door het feit dat het droogproces kan de micellaire structuur vernietigen.

Zodra de gewijzigde Nafion polymeer en enzym zijn gemengd en samen gieten op de bodem van een cuvet, kan enzymatische activiteit metingen worden gebruikt om de stabiliteit van het enzym in de polymeerfilm beoordelen. Tabellen 2-4 tonen testresultaten van twee dehydrogenase enzymen en glucose oxidase geïmmobiliseerd in verschillende gemodificeerde Nafion films, respectievelijk. Let op de hogere activiteit van de enzymen die zijn geïmmobiliseerd opzichte van de enzymen in buffer oplossing blijkt dat gemodificeerde polymeren Nafion feite kan de activiteit van enzymen (de zogenaamde superactivity) te verbeteren. Andere enzymen transport beperkingen die de specifieke activiteit te verminderen wanneer ze immobiliseren in het polymeer (ie cellulases en amylasen, waarvan substraten zijn vrij grote macromoleculen).

Gebruikte quaternaire ammoniumzout	3 voudige overmaat
T3A (tetrapropylammonium bromide)	32,37 mg / ml
TBAB (tetrabutylammoniumbromide)	39,19 mg / ml
TPAB (tetrapentylammonium bromide)	46,01 mg / ml
Teha (triethylhexylammonium bromide)	32,37 mg / ml
TMHA (trimethylhexylammonium bromide)	27,25 mg / ml
TMOA (trimethyloctylammonium bromide)	30,66 mg / ml
TMDA (trimethyldecylammonium bromide)	34,07 mg / ml
TMDDA (trimethyldodecylammonium bromide)	37,48 mg / ml
TMTDA (trimethyltetradecylammonium bromide)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium bromide)	44,31 mg / ml
TMODA (trimethyloctadecylammonium bromide)	47,71 mg / ml

Tabel 1. Hoeveelheden tetra-alkyl ammoniumzouten te gebruiken voor Nafion polymeermodificatie.

Type Nafion	Enzym-activiteit (U / g)
Buffer (geen polymeer)	16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.)	9,25 ± 2,21
TMTDA	3,23 ± 2,92
TBAB	3,93 ± 3,33
TMDDA	4,19 ± 1,04
TMOA	3,51 ± 1,11
TMDA	8,00 ± 4,53
TMHA	1,68 ± 1,39
TMHDA	4,83 ± 0,99
TMODA	10,45 ± 3,20

Tabel 2 NAD-afhankelijke glucosetransportsysteem dehydrogenase activiteit geïmmobiliseerd in geselecteerde gemodificeerde polymeren Nafion (opmerking: geïmmobiliseerd activiteit is een functie van eerste specifieke activiteit van het enzym)..

Type Nafion	Enzymactiviteit (mU / g)
Buffer (geen polymeer)	7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.)	70,1 ± 0,5
TMTDA	133 ± 6
TBAB	244 ± 4
TMDDA	221 ± 6
TMOA	1,78 ± 0,63
TMDA	206 ±5
Teha	40,1 ± 50,6
TMHDA	0
TMODA	1,45 ± 0,06

Tabel 3 PQQ-afhankelijk glucose dehydrogenase activiteit geïmmobiliseerd in geselecteerde gemodificeerde polymeren Nafion (opmerking: geïmmobiliseerd activiteit is een functie van eerste specifieke activiteit van het enzym)..

Type Nafion	Enzym-activiteit (U / g)
Buffer (geen polymeer)	103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.)	19,93 ± 10,10
TMTDA	247,25 ± 12,49
TBAB	152,27 ± 5,29
TMDDA	262,05 ± 6,26
TMOA	129,18 ± 2,31	TMDA	141,23 ± 1,97
TMHA	131,75 ± 2,89
TMHDA	132,50 ± 1,18
TMODA	136,50 ± 0,96

. Tabel 4 Representatieve glucoseoxidase specifieke activiteit geïmmobiliseerd in geselecteerde gemodificeerde polymeren Nafion (opmerking: geïmmobiliseerd activiteit is een functie van eerste specifieke activiteit van het enzym).

Figuur 1. Schematische voorstelling van TBAB opname in Nafion polymeer en het daaropvolgende gebruik in enzym-immobilisatie.

Figuur 2. Optische foto van de eerste co-cast films van Nafion en TBAB. Langzaam drogen levert een transparant, lichtbruin film die de bottom van de weging lade.

Discussion

In de beschreven procedure worden tetra-alkyl ammoniumzouten gebruikt om commerciële Nafion wijzigen om micellaire polymeren die kunnen worden gebruikt immobiliseren en stabiliseren enzymen te maken. De assays beschreven in de procedure zien dat het polymeer kan worden gebruikt om een ​​groot aantal enzymen te immobiliseren met een hoge retentie activiteit. Als het enzym van belang heeft een zeer lage activiteit of onzuiver is, kan een hogere concentratie nodig zijn en mag geen invloed hebben op de immobilisatie proces, tenzij immobiliseren van enzymen in concentraties hoger dan 10 mg / ml. De eenvoud van de procedure scheidt van andere enzymen immobilisatie technieken die geen synthesestappen (zoals polymeer synthese of verknoping) vereist. Ook zijn deze synthetische stappen vaak denatureren eiwitten of drastisch verminderen hun activiteit. De eiwitconcentratie van 1mg/ml slechts een voorgesteld concentratie hoog enzym geladen. Lagere concentraties enzym kan altijd worden gebruikt,maar dit zal resulteren in minder volumetrische katalytische activiteit. In theorie kan een hogere enzymconcentraties worden gebruikt zolang als het enzym oplost.

Omdat de polymeren die oplosbaar zijn in lagere alifatische alcoholen zoals methanol, ethanol, propanol en een hoog percentage alcohol aanwezig zijn bij het mengen van de polymeersuspensie met een enzym. In veel gevallen is dit geen probleem als het ethanol verdampt tijdig wanneer het enzym ingekapselde film gegoten. Echter, een beperking van deze immobilisatie optreden als een enzym is helemaal alcohol-tolerant en denatureert of precipitaten na toevoeging van de gewijzigde Nafion suspensie. In zeldzame gevallen zal enzymen neerslag of denatureren bij menging met de gewijzigde Nafion schorsing, meestal aangeeft dat het enzym is gedenatureerd geworden en zal niet functioneren. Het is mogelijk om het alcoholgehalte te verlagen in de suspensie door de polymeren resuspenderen in alcohol / water mengsels, Maar lagere alifatische alcoholen dienen in hoge concentratie (> 25%) in de resuspensie oplossing is dus het immobiliseren techniek niet voor enzymen / enzymoplossingen die niet verdragen deze concentraties alcohol.

De enzymatische analyses voor elk van de polymeren met elk van de drie enzymen blijkt dat de ontwikkeling in relatieve specifieke activiteit in vergelijking met enzym in oplossing is een functie van het enzymsysteem. Verwacht wordt dat, omdat elk van de enzymen een verschillende grootte verschillende pI, verschillende optimale pH, en dat PQQ-afhankelijk glucosedehydrogenase een membraangeassocieerd eiwit en heeft daarom een ​​zeer verschillende chemische micro dat cytosolische eiwitten. Daarom is het hydrofoob gemodificeerde micellaire Nafion geeft een membraan-achtige milieu voor het stabiliseren van de actieve PQQ-afhankelijke glucose dehydrogenase dan buffer en toont superactivity, die zeldzaam is in geïmmobiliseerde enzymen. Eennother punt van overweging is dat de polymeer membranen transport van grote moleculen te verlagen en hoewel glucose (het substraat voor alle drie de tests hier afgebeeld) is klein, de co-enzym NAD nodig heeft om in en uit diffunderen van het membraan voor NAD-afhankelijke dehydrogenases en dit vermindert de enzymatische activiteit waargenomen. Over het algemeen is van belang dat de juiste polymeer nodig is voor elke enzym worden geoptimaliseerd, door de verschillen in grootte, lading, optimale pH en transport van substraat / cofactoren voor elk van de enzymsystemen.

Anders dan geïmmobiliseerd enzym assays, de eerste applicatie die is onderzocht met dit enzym immobilisatie methode is de fabricage van enzymatische biosensoren en biobrandstof cellen. Wanneer gemodificeerde polymeren die Nafion ingekapselde redox enzymen gieten op elektroden, kan bioelectrocatalytic processen plaatsvinden in aanwezigheid van geschikte substraten en cofactoren, waardoor een elektrische stroom response. Bioanodes vervaardigd met gemodificeerde Nafion zijn gebruikt biobrandstof cellen die ethanol, methanol, pyruvaat en glycerol, zoals beschreven in de inleiding gebruiken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nafion	Sigma-Aldrich	70160
Tetra alkylammonium bromide salts	Sigma-Aldrich	n/a
Alcohol dehydrogenase	Sigma-Aldrich	A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)	Simga-Aldrich	N7004
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	P8010
Phenazine methosulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP)	Sigma-Aldrich	D1878
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141
4-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	240141
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Peroxidase	Sigma-Aldrich	P8375
4-aminoantipyrine	Sigma-Aldrich	06800
UV/Vis Spectrophotometer	Thermo	Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance