Hydrofob Salt modifierade Nafion för enzymimmobilisering och stabilisering

Summary

Denna artikel beskriver ett förfarande för syntetisering av en hydrofobt modifierad Nafion-membranet enzymimmobilisering och hur man immobilisera proteiner och / eller enzymer i membranet och testa deras specifika aktivitet.

Abstract

Under det senaste årtiondet har det skett en mängd ansökan om immobiliserade och stabiliserade enzymer inklusive biokatalys, biosensorer och biobränsle celler. ^1-3 I de flesta bioelektrokemiska tillämpningar är enzymer eller organeller immobiliseras på en elektrod yta med användning av någon typ av polymermatrisen. Detta polymerskelettet bör hålla de enzymer stabila och möjliggöra enkel diffusion av molekyler och joner in i och ut ur matrisen. De flesta polymerer som används för denna typ av immobilisering är baserade på polyaminer eller polyalkoholer - polymerer som efterliknar den naturliga miljön om de enzymer som de inkapslar och stabiliserar enzymet genom väte eller jonbindning. En annan metod för stabilisering enzymer innefattar användningen av miceller, vilka innehåller hydrofoba regioner som kan inkapslar och stabiliserar enzymer. ^4,5 I synnerhet har det Minteer gruppen utvecklade en micellär polymer baserad på kommersiellt tillgängliga Nafion. ^6,7 Nafionsjälv är en micellär polymer som medger kanal-assisterad diffusion av protoner och andra små katjoner, men micellerna och kanaler är extremt små och polymeren är mycket sur på grund av sulfonsyragrupper sidokedjor, som är ogynnsamma för enzymimmobilisering. När emellertid Nafion blandas med ett överskott av hydrofoba alkyl-ammoniumsalter såsom tetrabutylammoniumbromid (TBAB), de kvartära ammoniumkatjoner ersätta protonerna och bli motjonerna till de sulfonatgrupper på de polymera sidokedjor (figur 1). Detta resulterar i större miceller och kanaler inuti polymeren som möjliggör diffusion av stora substrat och joner som är nödvändiga för enzymatisk funktion såsom nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD). Denna modifierade Nafion polymer har använts för att immobilisera många olika typer av enzymer och mitokondrier för användning i biosensorer och biobränsle celler. ^8-12 Detta dokument beskriver ett nytt förfarande för denna micellar polymer enzymimmobilisering membran som kan stabilisera enzymer. Syntesen av den micellära enzymimmobilisering membran, ett förfarande för immobilisering av enzymer i membranet, och analyserna för att studera enzymatiska specifika aktiviteten hos det immobiliserade enzymet i detalj nedan.

Protocol

1. Modifiering av Nafion med kvartära ammoniumsalter

1. Skaka en flaska 5% vikt / volym Nafion suspensionen kraftigt under ca. 30 sekunder för att säkerställa att Nafion suspenderas enhetligt i lösning.
2. Pipettera upp 2 ml av den nu åter upphängd Nafion i en glasflaska (injektionsflaska volym kan innehålla från 2,5 ml till 10 ml).
3. Mäta en 3-faldigt molärt överskott (i förhållande till de sulfonsyragrupper på Nafion polymeren) av alkyl-ammonium-bromid-salt (lämpliga massor visas i tabell 1) och addera till flaskan som innehåller 2 ml av Nafion.
4. Virvel flaskan vid 1500 rpm under 10-15 minuter.
5. Häll den viskösa lösningen i en plast som väger fack som mäter ca. 3 x 3 tum, och använd en pipett för att överföra eventuell kvarvarande lösning från injektionsflaska till väga facket.
6. Låt lösningsmedlen avdunsta ur vågskålen och lämnar en gul / brun, transparent film på botten av en vikt brickan (FiGure 2). Hastigheten för avdunstning av lösningsmedel bör vara sådan att det krävs mer än 6 timmar för alla lösningsmedlet får avdunsta. Om lösningsmedlet avdunstar för fort, kommer en vit, knaprig materiell form i stället för en transparent film som visar att micellär struktur av polymeren har förstörts, och du måste starta om proceduren. Om lösningsmedelsavdunstning är för långsam, kan en de-luftfuktare vara nödvändig, eftersom för långsam avdunstning normalt leder till en klibbig, orange gel och du måste starta om proceduren. Typiska temperaturintervall för lösningsmedelsavdunstning är 20 - 37 ° C. De faktiska förutsättningarna för torkning är en funktion av den relativa fuktigheten och temperaturen i rummet, men det är viktigt att torkning är långsam för att upprätthålla micell struktur, men inte alltför långsam för att medge gelbildning.
7. Fyll väger båten med 18M Qcm avjoniserat vatten (10-20 ml vatten), täck och låt dra i 12-24 timmar för att avlägsna överskott alkylammoniumsalter ammoniumbromid och HBr.
8. Låt väger facket att sitta utan lock tills polymeren är helt torrt Vid det här laget bör polymeren vara en tydlig och något spröda plastfilm. Återigen, om luften är mycket fuktig, kan en de-luftfuktare vara nödvändig för att slutföra avdunstning i god tid.
9. Med hjälp av en spatel, försiktigt bort den torkade filmen från vägningen facket och överföra det till en ren glasflaska.
10. Tillsätt 2 ml etanol och 3 keramiska blandning pärlor och virvelblandades under 4 timmar eller tills polymerfilmen är helt återuppslammas.

2. Immobilisering av enzymer i TBAB-Ändrad Nafion för aktivitetsanalyser

1. För en torr enzym, väg upp 1-10 mg av enzymet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 1 ml av 100 mM fosfatbuffert, pH 7 för att skapa en 1-10 mg / ml enzymlösning. For ett enzym som är i lösning, används en bicinkoninsyra (BCA)-analys ¹³ för att bestämma mängden av protein, och tillsätt en lämplig mängd av 100 mM fosfatbuffert för att bringa proteinkoncentrationen till 1-10 mg / ml. 1-10 mg / ml motsvarar typiskt doser om 1-50 nanomol per ml.
2. Till 120 | il av 1 mg / ml enzymlösning, tillsätt 60 | il av den alkyl-ammonium-modifierad Nafion-lösning och virvelblandades under 10 sekunder. (Denna blandning kan skalas upp till stora antal replikat. Håll enzym-till-polymer-lösningen var vid 2:1.)
3. Pipett 60 | il av enzymet / polymerlösningen in i botten av 3 separata 1 cm kyvetter ^2, och låt torka över natten.

3. Analys av immobiliserad NAD-beroende dehydrogenasenzym

1. Till kyvetten, tillsätt 1,3 ml 50 mM natriumpyrofosfat (pH 8,8), 1,5 ml 15 mM NAD (nyberedd), och 0,1 ml vatten.
2. Placera kuvetten i en UV / Vis-spektrofotometer (dvs. ThermoScientific Evolutjon 260 Bio och Thermo Spectronic Genesys 20) inställd på en våglängd på 340 nm.
3. Nollställ spektrometer, och sedan lägga till 0,1 ml etanol. Blanda reagensen genom att försiktigt pipettera lösningen upp och ned 5 gånger. För en tom använder 0,1 ml ytterligare vatten i stället för 0,1 ml etanol.
4. Registrera absorbans vid 340 nm vid 5 minuter efter de reagens sattes till kyvetten och 20 minuter efter. Rita de två datapunkter för att få en lutning som kan användas för aktivitet beräkningar.

4. Analys av immobiliserade PQQ-Dependent Dehydrogenaser

1. Till kyvetten, tillsätt 1,5 ml natriumfosfatbuffert (pH 7,3) och 200 | il av 600 pM PMS.
2. Placera kuvetten i en UV / Vis-spektrofotometer inställd på en våglängd av 600 nm och sedan nollställa spektrometer.
3. Tillsätt 100 pl av 700 | il DCIP och 200 pl av substratet av intresse (etanol, acetaldehyd, glycerol, glukos, eller glyceraldehyd), och blanda reagensen genom att försiktigt pipettera den solutjon upp och ned 5 gånger. För en tom använder 200 | il av vatten i stället för substrat av intresse.
4. Registrera absorbans vid 600 nm vid 5 minuter efter de reagens sattes till kyvetten och 20 minuter efter.

5. Analys av immobiliserade glukosoxidaset

1. Till kyvetten, tillsätt 2,0 ml av en lösning innehållande 0,2 M p-hydroxibensoesyra, 0,02% (vikt / volym) natriumazid, 128 U peroxidas, 0,3 mM 4-aminoantipyrin, 1 M kaliumfosfat, och 50 mM glukos. Blanda lösningen genom pipettering upp och ned 5 gånger.
2. Placera kuvetten i en UV / Vis-spektrofotometer inställd på en våglängd av 510 nm.
3. Registrera absorbansen vid 510 nm vid 5 minuter efter de reagens sattes till kyvetten och återigen vid 20 minuter efter.

6. Representativa resultat

Den micellär struktur hos den modifierade polymeren Nafion kan sönderdelas genom torkning det ursprungliga saltet / polymer sam-gjuten film för FASt. Figur 2 visar ett salt / polymer blandning som har torkats riktigt vilket resulterar i ett öppet, ljusbrun film. En film som torkar för snabbt kan resultera i ogenomskinliga, vita flingor av polymeren på grund av det faktum att torkningsprocessen kan förstöra micellär struktur.

När väl den modifierade Nafion polymer och enzym har blandats och samtidig göts på botten av en kyvett, kan enzymatiska aktivitet analyser användas för att bedöma stabiliteten av enzymet i polymerfilmen. 2-4 visar analysresultat av två dehydrogenasenzymer tabellerna och glukos oxidas immobiliseras i olika modifierade Nafion filmer, respektive. Notera den högre aktiviteten hos de enzymer som är immobiliserade vs enzymerna i buffertlösning, som visar att modifierade Nafion polymerer faktiskt kan förstärka aktiviteten av vissa enzymer, vilka anropas superactivity). Andra enzymer har transportsystem begränsningar som minskar deras specifika aktivitet när immobilisera dem i polymeren (dvs cellulaser och amylaser, vars substrat är ganska stora makromolekyler).

Kvatemärt ammoniumsalt som används	3-faldigt överskott
T3A (tetrapropylammoniumbromid)	32,37 mg / ml
TBAB (tetrabutylammonium-bromid)	39,19 mg / ml
TPAB (tetrapentylammonium-bromid)	46,01 mg / ml
TEHA (triethylhexylammonium bromid)	32,37 mg / ml
TMHA (trimetylhexylammonium bromid)	27,25 mg / ml
TmoA (trimethyloctylammonium bromid)	30,66 mg / ml
TMDA (trimethyldecylammonium bromid)	34,07 mg / ml
TMDDA (trimethyldodecylammonium bromid)	37,48 mg / ml
TMTDA (trimethyltetradecylammonium bromid)
TMHDA (trimethylhexadecylammonium bromid)	44,31 mg / ml
TMODA (trimethyloctadecylammonium bromid)	47,71 mg / ml

Tabell 1. Mängder av tetra-alkylammoniumsalter använda för Nafion polymermodifiering.

Typ av Nafion	Enzymaktivitet (U / g)
Buffert (ingen polymer)	16,63 ± 8,11
Nafion (un-mod.)	9,25 ± 2,21
TMTDA	3,23 ± 2,92
TBAB	3,93 ± 3,33
TMDDA	4,19 ± 1,04
TmoA	3,51 ± 1,11
TMDA	8,00 ± 4,53
TMHA	1,68 ± 1,39
TMHDA	4,83 ± 0,99
TMODA	10,45 ± 3,20

Tabell 2 NAD-beroende glukosdehydrogenas aktivitet immobiliseras i utvalda modifierade Nafion polymerer (obs: immobiliserade aktivitet är en funktion av initial specifik aktivitet av enzymet)..

Typ av Nafion	Enzymaktivitet (mU / g)
Buffert (ingen polymer)	7,18 ± 0,51
Nafion (un-mod.)	70,1 ± 0,5
TMTDA	133 ± 6
TBAB	244 ± 4
TMDDA	221 ± 6
TmoA	1,78 ± 0,63
TMDA	206 ±5
TEHA	40,1 ± 50,6
TMHDA	0
TMODA	1,45 ± 0,06

Tabell 3 PQQ-beroende glukosdehydrogenas aktivitet immobiliseras i utvalda modifierade Nafion polymerer (obs: immobiliserade aktivitet är en funktion av initial specifik aktivitet av enzymet)..

Typ av Nafion	Enzymaktivitet (U / g)
Buffert (ingen polymer)	103,61 ± 3,15
Nafion (un-mod.)	19,93 ± 10,10
TMTDA	247,25 ± 12,49
TBAB	152,27 ± 5,29
TMDDA	262,05 ± 6,26
TmoA	129,18 ± 2,31	TMDA	141,23 ± 1,97
TMHA	131,75 ± 2,89
TMHDA	132,50 ± 1,18
TMODA	136,50 ± 0,96

. Tabell 4 representant glukosoxidas specifik aktivitet immobiliseras i utvalda modifierade Nafion polymerer (obs: immobiliserade aktivitet är en funktion av initial specifik aktivitet av enzymet).

Figur 1. Schematisk av TBAB inkorporering i Nafion polymer och efterföljande användning i enzymimmobilisering.

Figur 2. Optisk fotografi av första sam-gjutna filmer av Nafion och TBAB. Långsam torkning ger ett transparent ljusbrun film som täcker bottom att vägningen facket.

Discussion

I den beskrivna förfarandet, är tetra-alkylammoniumsalter användas för att modifiera kommersiellt Nafion för att skapa micellära polymerer som kan användas för att immobilisera och stabilisera enzymer. De analyser som beskrivs i förfarandet framgår att polymeren kan användas för att immobilisera en stor mängd enzymer med en hög retention av aktivitet. Om enzymet av intresse har en mycket låg aktivitet eller är oren, kan en högre koncentration erfordras, och bör inte påverka immobiliseringsprocessen, såvida immobilisera enzymer i högre koncentrationer än 10 mg / ml. Enkelheten hos förfarandet separerar den från andra tekniker enzymimmobiliseringsmetoder i att inga syntessteg (såsom polymer-syntes eller tvärbindning) erfordras. Även dessa syntesstegen denaturera ofta proteiner eller dramatiskt minskar sin verksamhet. Proteinkoncentrationen hos 1mg/mL är endast ett förslag koncentration för hög enzym belastning. Lägre enzymkoncentrationer kan alltid användas,men kommer att resultera i mindre volymetrisk katalytisk aktivitet. I teorin kan högre enzymkoncentrationer användas så länge som det enzym upplöses.

Eftersom polymererna är lösliga i lägre alifatiska alkoholer såsom metanol, etanol och propanol, en hög andel av alkoholen skall vara närvarande vid blandning av polymeren suspensionen med ett enzym. I många fall är detta inte ett problem så länge som den Etanolen avdunstas i en rimlig tid när den enzym-inkapslade film gjutes. Dock kan en begränsning av denna immobilisering förekomma om ett enzym är inte alls alkohol-tolerant och denaturerar eller fällningar vid tillsats av den modifierade Nafion suspension. I sällsynta fall kan enzymer fällning eller förstörs när de blandas med den modifierade Nafion suspension, vilket indikerar oftast att enzymet har blivit denatureras och kommer inte att fungera. Det är möjligt att minska alkoholhalten i suspensionen genom återsuspendering av polymererna i alkohol / vatten-blandningar, Men lägre alifatiska alkoholer krävs betydande koncentrationer (> 25%) i resuspension lösningen fungerar så detta immobilisering teknik inte för enzymer / lösningar enzym som inte tål dessa koncentrationer av alkohol.

De enzymatiska analyser för var och en av polymererna med var och en av de tre enzymerna visar att utvecklingen av relativa specifika aktiviteten jämfört med enzymet i lösning är en funktion av enzymsystemet. Detta förväntas, eftersom var och en av de enzymer är en annan storlek, olika pl, olika optimala pH, såväl som det faktum att PQQ-beroende glukosdehydrogenas är ett membranassocierat protein och behöver därför en helt annan kemisk mikromiljö som cytosoliska proteiner. Därför ger hydrofobt modifierade micellära Nafion en mer membranliknande miljö för att stabilisera den aktiva PQQ-beroende glukosdehydrogenas än bufferten och visar superactivity, vilket är ovanligt i immobiliserade enzymer. Ennother fråga att tänka på är att polymermembraner minskar transport av stora molekyler och även glukos (substratet för alla tre tester som visas här) är liten, behöver coenzym NAD att diffundera in och ut ur membranet för NAD-beroende dehydrogenaser och detta minskar observerades enzymatisk aktivitet. Totalt sett är det viktigt att notera att den exakta polymer behövs för varje enzym måste optimeras, på grund av skillnaderna i storlek, laddning, optimalt pH, och transport av substratet / co-faktorer för vardera av de enzymsystem.

Annat än immobiliserade enzymanalyser, är den primära program som har undersökts med detta enzym immobilisering metod tillverkning av enzymatiska biosensorer och biobränsle celler. När modifierade Nafion polymerer innehållande inkapslade redoxenzymer är gjutet på elektrodytorna kan bioelectrocatalytic processer ske i närvaro av lämpliga substrat och kofaktorer som producerar en elektrisk ström response. Bioanodes tillverkade med modifierad Nafion har använts i biobränsle celler som utnyttjar etanol, metanol, pyruvat och glycerol, som beskrivs i inledningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nafion	Sigma-Aldrich	70160
Tetra alkylammonium bromide salts	Sigma-Aldrich	n/a
Alcohol dehydrogenase	Sigma-Aldrich	A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)	Simga-Aldrich	N7004
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	P8010
Phenazine methosulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP)	Sigma-Aldrich	D1878
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141
4-Hydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	240141
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Peroxidase	Sigma-Aldrich	P8375
4-aminoantipyrine	Sigma-Aldrich	06800
UV/Vis Spectrophotometer	Thermo	Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance