在人类后基因组时代,在本机构的重组蛋白的结构,功能和治疗的研究和发展是至关重要的。在这里,我们描述了测试和大规模的蛋白质在人类胚胎肾细胞293T,可用于生产各种重组蛋白表达系统。
重组蛋白在细菌中表达,通常大肠杆菌大肠杆菌 ,一直毫克的蛋白质数量表达的最成功的战略。然而,原核主机通常是不为人类,病毒或真核蛋白质由于外国高分子毒性,在蛋白质折叠机制的差异,或因缺乏特别合作或翻译后的修改,在细菌的适当表达。基于酵母( 毕赤酵母或酵母 )1,2,杆状病毒感染的昆虫(S.秋行军虫或 T 妮 )细胞3,和无细胞体外翻译系统的表达系统2,4已被成功地用于生产哺乳动物蛋白质。直观,最匹配的是,使用哺乳动物的主机,以确保包含正确的翻译后修饰的重组蛋白的生产。一些哺乳动物细胞株人类胚胎小子(滋肾(HEK)293,C V-1细胞在 O rigin携带的 S V40 larget T抗原(COS)中国仓鼠卵巢(CHO),和其他人)已成功地利用过度毫克数量的人体蛋白质数量5-9。然而,使用哺乳动物细胞中的优势往往成本较高,专业实验室设备的需求,降低蛋白质产量,和漫长的时间发展稳定表达细胞株的反击。提高产量和生产蛋白质的速度,同时保持成本低,是许多学术和商业实验室的主要因素。
在这里,我们描述了时间和成本效益,由两部分组成,附着HEK 293T细胞分泌的人类蛋白质表达过程。这个系统是能够生产微克到毫克数量的功能蛋白质结构,生物物理和生物化学研究。第一部分,是产生多个感兴趣的基因结构并行和瞬时转成小规模的附着的HEK 293T细胞。重组蛋白分泌到细胞培养液中的检测和分析,进行印迹分析,使用市售的抗体对矢量编码的蛋白质纯化标签指示。随后,适合大规模蛋白质生产结构瞬时转染使用聚乙烯亚胺(PEI)在10层的细胞工厂。成升体积的条件培养基中分泌蛋白集中到管理大量使用切向流过滤,净化,抗HA的亲和层析。这个平台的效用证明毫克量的细胞因子,细胞因子受体,细胞表面的受体,内在的制约因素,与病毒糖蛋白的表达能力。这种方法也被成功地用于三聚ebolavirus糖5,10结构的决心。
<p c姑娘="的“jove_content”的结论">,此平台提供易于使用,速度和可扩展性,同时最大限度地提高蛋白质的质量和功能。此外,没有额外的设备,比标准培养箱二氧化碳培养箱 ,是必需的。这个过程可能会迅速扩大到更复杂的系统,如蛋白质复合物,抗原和抗体,疫苗生产的病毒样颗粒,或生产困难的细胞株转导的腺病毒或慢病毒表达。10层的细胞工厂生产毫克的蛋白质数量的有效容器。使用超过其他传统的船只,如滚瓶,摇瓶或微调瓶,电池工厂的一个主要优点是,它们不需要任何额外的实验室设备的采购。一个标准的二氧化碳培养箱(6.0立方英尺)轻松容纳4个10层的细胞工厂( 图2)。此外,这些船只需要较少的劳动比菜,瓶或滚瓶细胞和蛋白质的产生和空间;一个10层的细胞工厂,相当于使用7.5定期滚?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由安大略省的艾滋病毒治疗网络研究工作津贴(的ROG-G645)和加拿大健康研究的新研究者奖(的MSH-113554)研究院JEL和多伦多大学的奖学金支持HA,FCA和纪委。笔者想感谢在斯克里普斯研究所(拉霍亚加州)马妮福斯科,Dafna先生Abelson和埃里卡Ollmann萨费尔博士提供细胞,ebolavirus; GP表达载体和一般建议。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
CO2 | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
Glycine | Sigma | G8898 | |
Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
phosphatase-conjugated antibody | |||
Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
(sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
NaN3 | Sigma | S8032 | |
pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
Skim milk dry powder | Carnation | ||
Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
0.22 μm, 500 ml capacity | |||
Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
Tween-20 | Sigma | P7949 | |
Valproic acid | Sigma | P4543 | |
Centramate tangential flow system | Pall | ||
CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
Incubator, 37 °C | various brands are available |