(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות ב<em> חיידקי Escherichia</em>.
פנוטיפים נקבעים על ידי סדרה מורכבת של אינטראקציות פיסיות (בין חלבונים לדוגמה) ופונקציונליות (גני גן או גנטי לדוגמה) (GI) 1. בעוד אינטראקציות פיסיות יכולות להעיד שחלבונים חיידקיים משויכים כמתחמים, שהם לא בהכרח לחשוף relationships1 הפונקציונלי מסלול ברמה. מסכי מערכת עיכול, שבו הצמיחה של מוטנטים כפולים, ושני גנים שנמחקו או מומתים נמדדה והשוואה למוטנטים הבודדים המתאימים, יכולים להאיר תלות epistatic בין לוקוסים ומכאן לספק אמצעים לשאילתה ולגלות קשרים פונקציונליים חדשים 2. מפות GI בקנה מידה גדולה כבר דיווחו לאורגניזמים האיקריוטים כמו שמרים 3-7, אך מידע GI נותר דליל לפרוקריוטים 8, אשר מעכב את הביאור הפונקציונלי של הגנום של חיידקים. לשם כך, אנחנו ואחרים פתחנו שיטות תפוקה גבוהה כמותיים חיידקים במערכת עיכול הקרנה 9, 10 </sup>.
כאן, אנו מציגים את השלבים העיקריים הנדרשים לביצוע ה כמותית coli מערך הליך סינטטי גנטי (eSGA) הקרנה על הגנום בהיקף 9, תוך שימוש בנטייה טבעית חיידקים והומולוגיים רקומבינציה המערכתית כדי להפיק ולמדוד את הכושר של מספר גדול של מוטציות כפולות בפורמט מערך מושבה. בקצרה, רובוט משמש להעברה , דרך הצמידה chloramphenicol (CM) – מסומן אללים מוטנטים מHFR המהונדס (תדירות גבוהה של רקומבינציה) 'זנים תורמים' למערך מסודר של kanamycin (קאן) – זנים מסומנים F-נמענים. בדרך כלל, אנחנו משתמשים במוטציות אובדן של פונקציה בודדות נושא מחיקות גנים שאינם חיוניות (למשל, האוסף 'קיו' 11) ומוטציות גנטיות hypomorphic חיוניות (כלומר האללים מקנים ביטוי מופחת חלבון, יציבות, או פעילות 9, 12, 13) כדי שאילתא העמותות הפונקציונליות של גנים שאינם חיוניים והכרחיים, מילpectively. לאחר הצמיד ותיווך חילופים גנטי שהתפתח על ידי הומולוגי רקומבינציה, המוטציות הכפולות כתוצאה מכך הם נבחרו על המצע מוצק המכיל גם אנטיביוטיקה. לאחר תולדה, הצלחות הם צלמו באופן דיגיטלי וגדלי מושבת כמותית מקבלים נקודות באמצעות מערכת בבית אוטומטית עיבוד תמונת 14. החיילים אמריקאים מתגלים כאשר שיעור הצמיחה של מוטציה כפולה הוא גם באופן משמעותי טוב יותר או גרוע יותר מצפויים 9. חיילים אמריקאים מחמירים (או שלילי) לעתים קרובות תוצאה בין מוטציות אובדן של פונקציה בזוגות של גנים ממסלולי פיצוי התלויים באותו התהליך החיוני 2. הנה, אובדנו של גן יחיד נאגר, כך שגם מוטציה אחת היא בת קיימא. עם זאת, ההפסד של שני המסלולים הוא מזיק ותוצאות בהקטלניות או מחלה סינטטיות (כלומר צמיחה איטית). לעומת זאת, אינטראקציות הקלה (או חיובי) יכולות להתרחש בין גנים באותו מסלול או חלבון מורכב 2 כמומחיקה של שני הגנים בלבד היא לעתים קרובות מספיק כדי לטרוד את התפקוד התקין של המסלול או המורכב כגון הפרעות נוספות שלא לצמצם את הפעילות, ולכן צמיחה, נוספת. בסך הכל, באופן שיטתי זיהוי וניתוח רשתות GI יכול לספק מפות משוחדות, גלובליות של קשרים הפונקציונליים בין מספר הגדול של גנים, שממנו מידע מסלול ברמה החמיץ ידי גישות אחרות ניתן להסיק 9.
נציין פרוטוקול צעד חכם לשימוש בהקרנת eSGA רובוטית לחקור פונקציות גני חיידקים ברמת מסלול על ידי חוקר במערכת עיכול. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור גנים בודדים, כמו גם מערכות ביולוגיות שלמות בE. coli. זהירות ביצוע צעדי הניסוי שתוארו לעיל, כולל את כל הבקרות המתאימות, וקפדנו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהגנום קנדה, מכון ג'נומיקס אונטריו, והמכון הקנדי למענקי מחקר לבריאות JG ו AE AG הוא מקבל מלגת Vanier קנדה בוגר.
I. Antibiotics | 2 | 36471 Remove |
||||
Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | 3 | 36472 Remove |
||
Kanamycin | #KAN201 | 4 | 36480 Remove |
|||
Ampicillin | # AMP201 | 5 | 36473 Remove |
|||
2. Luria-Bertani medium | 6 | 36474 Remove |
||||
LB powder | Bioshop | #LBL405 | 7 | 36478 Remove |
||
Agar | Bioshop | #AGR003 | 8 | 36481 Remove |
||
3. Bacterial Strains and Plasmids | 9 | 36475 Remove |
||||
Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | 10 | 36476 Remove |
|||
pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | 11 | 36477 Remove |
|||
Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | 12 | 36479 Remove |
|||
Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | 13 | 36491 Remove |
|||
4. Primers | 14 | 36486 Remove |
||||
pKD3-based desalted constant primers | F1: 5′-GGCTGACATGGGAATTAGC-3′ R1: 5′-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3′ |
15 | 36482 Remove |
|||
Desalted custom primers | Cm-R: 5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′ Cm-F: 5′- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3′ |
16 | 36483 Remove |
|||
Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5′-CATATGAATATCCTCCTTA-3′ R2 constant region: 5′-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5’AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3′ S2 constant region: 5′- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3′ KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
17 | 36484 Remove |
|||
5. PCR and Electrophoresis Reagents | 18 | 36485 Remove |
||||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | 19 | 36487 Remove |
||
10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | 20 | 36488 Remove |
||
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | 21 | 36489 Remove |
||
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | 22 | 36490 Remove |
||
Agarose | Bioshop | # AGA002 | 23 | 36492 Remove |
||
Loading dye | NEB | #B7021S | 24 | 36493 Remove |
||
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | 25 | 36497 Remove |
||
10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | 26 | 36494 Remove |
||
Tris Base | Bioshop | # TRS001 | 27 | 36495 Remove |
||
Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | 28 | 36496 Remove |
||
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | 29 | 36498 Remove |
||
DNA ladder | NEB | #N3232L | 30 | 36499 Remove |
||
6. DNA isolation and Clean-up Kits | 31 | 36500 Remove |
||||
Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | 32 | 36501 Remove |
||
Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | 33 | 36502 Remove |
||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | 34 | 36512 Remove |
||
7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | 35 | 36503 Remove |
||||
Thermal cycler | BioRad, iCycler | 36 | 36504 Remove |
|||
Agarose gel electrophoresis | BioRad | 37 | 36505 Remove |
|||
Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | 38 | 36506 Remove |
|||
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 39 | 36507 Remove |
|||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | 40 | 36508 Remove |
|||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | 41 | 36519 Remove |
|||
32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | 42 | 36509 Remove |
|||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | 43 | 36510 Remove |
|||
RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | 44 | 36511 Remove |
|||
96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | 45 | 36513 Remove |
|||
96 or 384 long pins | Singer Instruments | 46 | 36514 Remove |
|||
8. Imaging Equipments | 47 | 36515 Remove |
||||
Camera stand | Kaiser | 48 | 36516 Remove |
|||
Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | 49 | 36517 Remove |
|||
Light boxes, Testrite 16″ x 24″ units | Testrite | 50 | 36527 Remove |
|||
9. Pads or Plates Recycling | 51 | 36518 Remove |
||||
10% bleach | Any Vendor | 52 | 36520 Remove |
|||
70% ethanol | Any Vendor | 53 | 36521 Remove |
|||
Sterile distilled water | Any Vendor | 54 | 36522 Remove |
|||
Flow hood | Any Vendor | 55 | 36523 Remove |
|||
Ultraviolet lamp | Any Vendor | 56 | 36524 Remove |
|||
10. Labware | 57 | 36525 Remove |
||||
50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | 58 | 36526 Remove |
|||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | 59 | 36528 Remove |
|||
250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | 60 | 36529 Remove |
||
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | 61 | 36530 Remove |
||
Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | 62 | 36531 Remove |
||
Rectangular Plates | Singer Instruments | 63 | 36532 Remove |
|||
96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | 64 | 36533 Remove |
||
Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | 65 | 36535 Remove |
||
plates | ABgene | # AB-0580 | 66 | 36534 Remove |
||
Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | 67 | 36537 Remove |
||
-80 °C freezer | Any Vendor | 68 | 36536 Remove |