細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em>大腸菌</em>合成遺伝子配列を用いて
Summary
体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述<em>大腸菌</em>。
Abstract
表現型は、物理（蛋白質-蛋白質など ）と機能（ 例えば遺伝子遺伝子または遺伝的）相互作用（GI）1一連の複雑によって決定されます。物理的な相互作用が細菌のタンパク質が複合体として関連付けられているかを示すことができますが、それらは必ずしも経路レベルの機能relationships1を明らかにしない。 2削除または不活性化された遺伝子をもつ二重変異株の増殖を測定し、対応する単一の変異体と比較されるGIの画面は、遺伝子座の間の上位性の依存性を照らすそれゆえ小説機能的関係2を照会し、発見するための手段を提供することができる。大規模GIマップは酵母3月7日のような真核生物のために報告したが、GIの情報は、細菌ゲノムの機能アノテーションを妨げる原核8日のための疎のままされています。この目的のために、我々と他の人は、ハイスループット定量的な細菌性胃腸スクリーニング方法（9）（10）を開発しました</>（商標）。
ここでは、定量的なEを実行するために必要な主要な手順を提示全身的に生成し、コロニー配列形式の二重変異体の多数の適合度を測定するために自然な細菌接合と相同組換えを用いて大腸菌ゲノムスケールの9の合成遺伝子アレイ（eSGA）スクリーニング手順は、 簡単に述べると、ロボットを転送するために使用され、共役を介して、クロラムフェニコール（Cm） – 著しいF-レシピエント株 – （組換えの高周波）エンジニアリングHFRから変異アレルをマーク 'ドナー株'カナマイシン（菅）の規則正しい配列にします。一般的に、我々はに機能喪失型の非必須遺伝子欠失をもつ単一突然変異（ '慶應義塾'コレクション11 など ）と必須遺伝子hypomorphic変異（還元タンパク質の発現、安定性、または活動9、12、13を付与する 、すなわち対立遺伝子）を使用非必須と必須遺伝子の機能アソシエーション、resを問い合わせるpectively。相同組換えによる共役とその後の遺伝子交換を媒介した後、得られた二重変異体は、両方の抗生物質を含有する固体培地上で選択されています。伸長した後、プレートをデジタル画像化されるとコロニーサイズを定量的に社内自動画像処理システム14を用いて採点されます。二重変異体の成長率はどちら有意に良好または9予想以上に悪化しているときにGISは明らかにされています。悪化（または負）GISは、多くの場合、同じ基本的なプロセス2に当たる代償経路からの遺伝子のペアにおける機能喪失型変異との間に生じる。ここでは、単一の遺伝子の損失は、単一の変異が生存可能であるように、バッファリングされます。しかし、両経路の損失は有害であると合成致死性または病気（ すなわち低成長）が返されます。逆に、緩和（または正）の相互作用と同じ経路またはタンパク質複合体2の遺伝子の間に発生する可能性がありますいずれかの遺伝子の欠失だけでは、多くの場合、追加摂動はさらに、活性を低下させるため、成長しないような経路または複合体の正常な機能を混乱させるのに十分である。全体的に、体系的にGIのネットワークを識別し、分析することは、他の手法では見逃さ経路レベルの情報が9推測することができ、そこから多数の遺伝子間の機能的関係の公平、グローバルマップを提供することができます。
Protocol
1。 15遺伝子改変技術によりHFRカヴァッリドナー変異株を構築し、16 eSGAドナー汚れを構築するための手順を以下に説明します。簡単に言えば、我々は対象とλを使う-赤は非必須遺伝子の欠失変異体（1.1項）またはHUPとして使用されている必須遺伝子hypomorphic変異ドナー株（セクション1.2）を作成し、PCRによって生成された増幅選択可能なDNAマ?…
Representative Results
GIs reveal functional relationships between genes. Similarly, since genes in the same pathway display similar GI patterns and the GI profile similarity represents the congruency of phenotypes, we can group functionally related genes into pathways by clustering their GI profiles. Integrating GI and GI correlation networks with physical interaction information or other association data, such as genomic context (GC) relationships can also reveal the organization of higher-order functional modules that define core bio…
Discussion
我々は、GIを問い合わせることによって経路レベルで細菌の遺伝子の機能を調べるためにロボットeSGAスクリーニングを使用するための段階的なプロトコルについて概説しました。このアプローチは、 大腸菌内の個々の遺伝子だけでなく、全体のシステム生物学を研究するために使用することができます大腸菌 。慎重に実験手順を実行すると、すべての適切なコントロールを含?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ゲノムカナダ、オンタリオ州ゲノミクス研究所、保健研究助成金のカナダの協会からJGとAE社への資金によってサポートされていましたヴァニエ·カナダ大学院奨学金の受賞者です。
Materials
| I. Antibiotics | 2 | 36471 Remove |
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| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | 3 | 36472 Remove |
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| Kanamycin | #KAN201 | 4 | 36480 Remove |
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| Ampicillin | # AMP201 | 5 | 36473 Remove |
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| 2. Luria-Bertani medium | 6 | 36474 Remove |
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| LB powder | Bioshop | #LBL405 | 7 | 36478 Remove |
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| Agar | Bioshop | #AGR003 | 8 | 36481 Remove |
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| 3. Bacterial Strains and Plasmids | 9 | 36475 Remove |
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| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | 10 | 36476 Remove |
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| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | 11 | 36477 Remove |
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| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | 12 | 36479 Remove |
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| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | 13 | 36491 Remove |
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| 4. Primers | 14 | 36486 Remove |
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| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5′-GGCTGACATGGGAATTAGC-3′ R1: 5′-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3′ |
15 | 36482 Remove |
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| Desalted custom primers | Cm-R: 5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′ Cm-F: 5′- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3′ |
16 | 36483 Remove |
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| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5′-CATATGAATATCCTCCTTA-3′ R2 constant region: 5′-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5’AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3′ S2 constant region: 5′- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3′ KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
17 | 36484 Remove |
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| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | 18 | 36485 Remove |
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| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | 19 | 36487 Remove |
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| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | 20 | 36488 Remove |
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| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | 21 | 36489 Remove |
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| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | 22 | 36490 Remove |
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| Agarose | Bioshop | # AGA002 | 23 | 36492 Remove |
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| Loading dye | NEB | #B7021S | 24 | 36493 Remove |
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| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | 25 | 36497 Remove |
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| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | 26 | 36494 Remove |
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| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | 27 | 36495 Remove |
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| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | 28 | 36496 Remove |
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| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | 29 | 36498 Remove |
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| DNA ladder | NEB | #N3232L | 30 | 36499 Remove |
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| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | 31 | 36500 Remove |
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| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | 32 | 36501 Remove |
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| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | 33 | 36502 Remove |
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| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | 34 | 36512 Remove |
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| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | 35 | 36503 Remove |
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| Thermal cycler | BioRad, iCycler | 36 | 36504 Remove |
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| Agarose gel electrophoresis | BioRad | 37 | 36505 Remove |
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| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | 38 | 36506 Remove |
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| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | 39 | 36507 Remove |
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| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | 40 | 36508 Remove |
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| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | 41 | 36519 Remove |
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| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | 42 | 36509 Remove |
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| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | 43 | 36510 Remove |
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| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | 44 | 36511 Remove |
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| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | 45 | 36513 Remove |
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| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | 46 | 36514 Remove |
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| 8. Imaging Equipments | 47 | 36515 Remove |
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| Camera stand | Kaiser | 48 | 36516 Remove |
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| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | 49 | 36517 Remove |
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| Light boxes, Testrite 16″ x 24″ units | Testrite | 50 | 36527 Remove |
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| 9. Pads or Plates Recycling | 51 | 36518 Remove |
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| 10% bleach | Any Vendor | 52 | 36520 Remove |
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| 70% ethanol | Any Vendor | 53 | 36521 Remove |
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| Sterile distilled water | Any Vendor | 54 | 36522 Remove |
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| Flow hood | Any Vendor | 55 | 36523 Remove |
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| Ultraviolet lamp | Any Vendor | 56 | 36524 Remove |
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| 10. Labware | 57 | 36525 Remove |
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| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | 58 | 36526 Remove |
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| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | 59 | 36528 Remove |
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| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | 60 | 36529 Remove |
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| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | 61 | 36530 Remove |
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| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | 62 | 36531 Remove |
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| Rectangular Plates | Singer Instruments | 63 | 36532 Remove |
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| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | 64 | 36533 Remove |
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| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | 65 | 36535 Remove |
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| plates | ABgene | # AB-0580 | 66 | 36534 Remove |
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| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | 67 | 36537 Remove |
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| -80 °C freezer | Any Vendor | 68 | 36536 Remove |
References
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Bacterial Functional NetworksPathwaysEscherichia ColiSynthetic Genetic ArraysPhenotypesPhysical InteractionsFunctional InteractionsGene-gene InteractionsGenetic InteractionsGI ScreensEpistatic DependenciesFunctional RelationshipsLarge-scale GI MapsProkaryotesFunctional AnnotationBacterial GenomesQuantitative Bacterial GI Screening MethodsE. Coli Synthetic Genetic Array (eSGA) Screening ProcedureGenome-scale Screening
Citer Cet Article
Gagarinova, A., Babu, M., Greenblatt, J., Emili, A. Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays. J. Vis. Exp. (69), e4056, doi:10.3791/4056 (2012).