Summary
السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.
Protocol
ملاحظة أولية
يجب إجراء الجراحة من قبل المحققين المدربين بشكل كامل بناء على موافقة من السلطات المحلية لرعاية الحيوان. ويجب اتخاذ جميع الاحتياطات للحد من الألم والإجهاد الذي أصاب الحيوان بما في ذلك التخدير العميق، وإدارة التسكين بعد العملية الجراحية، وبالنسبة لعمليات استمرت أكثر من 10 دقيقة، وتطبيق لزيوت التشحيم لمنع الجفاف العين القرنية وفقدان البصر. يجب أن تبقى الفئران تخدير الدافئة باستمرار عند 37 درجة مئوية حتى الشفاء التام وكل أداة جراحية والحل يجب أن يكون معقم. على الرغم من أن استخدام غطاء البيولوجية ليست ضرورية تماما، يتعين على المشغل اتخاذ جميع الاحتياطات المعقولة لتقليل إمكانية إصابة الحيوان أثناء عملية من خلال ارتداء معطف المختبر، وقناع، وقفازات. وبالمثل، يجب أن يؤذن في كل خطوة بشأن توليد واستخدام الفيروسات ويجب إجراء في المناطق S2 وفقا للوائح السلطات المحلية.وأخيرا، لا بد من إجراء إزالة التلوث شامل لجميع الأدوات والأسطح التي كان يمكن أن تكون على اتصال مع فيروسات وفقا لممارسات التطهير وافق مرفق (لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق محو مع 70٪ ET-OH و / أو التعقيم).
الجزء 1: توسيع مجلس الأمن القومي الجنينية
1. في الرحم الصعق الكهربائي
- بعد استنساخ جينات منقولة (أي cdk4/cyclinD1) في PCMS-EGFP (Clontech) أو pDSV-mRFPnls ناقلات 16، تنقية البلازميدات باستخدام عدة EndoFree و resuspend في برنامج تلفزيوني العقيمة إلى تركيز من 3-5 ميكروغرام / ميكرولتر. قريبا قبل الجراحة، مزج البلازميدات مع FastGreen 0.05٪ في برنامج تلفزيوني في نسبة النهائي من كاليفورنيا. وأجهزة الطرد المركزي 04:04:01 الخليط لمدة 2 دقيقة في 16000 XG لإزالة رواسب جميع.
- تحميل خليط الحمض النووي في الزجاج البورسليكات سحبت سابقا الشعرية. سحب المعلمات باستخدام P-97 ماصة مجتذب هي: سحب: 200؛ VEL: 140؛ الوقت: 140. وتعطى الحرارة عن طريق اختبار منحدر ويعتمد على المواصفاتتستخدم الكثير من الشعيرات الدموية IFIC. تحميل الشعرية على فوهة من PicoPump التي تقع بالقرب من منصة الصعق الكهربائي في الرحم (الشكل 1A)، وتحت stereomicroscope، ينحني طرفها ونيك أنه عند نقطة انعطاف.
- تعقيم جميع الأدوات جراحة التعقيم في الزجاج حبة الجافة وتخدير عميق ماوس الحوامل في يوم 12-15 من الحمل باستخدام المرذاذ isoflurane. وضع الحيوان في موقف ضعيف على منصة وضعت في التدفئة 37 ° C ويبقي قيد الإدارة isoflurane مستمرة من خلال مخروط الأنف.
- حلق جلد البطن، مع تطهير مرات Betaisodona متعددة، في نهاية المطاف في القضاء بين مع الايثانول 70٪، وحقن البوبرينورفين (مخففة في PBS) تحت الجلد عند 0.1 ملغم / كغم من التركيز ومسكن وقائي. باستخدام مقص غرامة، وجعل قطع طولية 2 سم من الجلد، وبالتالي، من الجدار العضلي الكامنة للوصول إلى التجويف البريتوني. الاستغناء في كاليفورنيا التجويف البريتوني. 2prewarmed مل من محلول IUE (D-PBS تحتوي على 100 U / مل من القلم / بكتيريا) في 37 ° C والحفاظ على الحل على كتلة التدفئة.
- تغطية الفأر مع drap معقمة تحتوي على الشق الذي سيتم إزالة الرحم. التراجع عن شق باستخدام مبعاد التنغستن، وتحديد الرحم وتخلعها عقده مع ملقط بين الأجنة المجاورة (1B الشكل؛ يسار) ووضع عليه أخيرا على drap العقيمة. خلال العملية برمتها، وشطف الرحم بمحلول IUE لترطيب تجويف الجسم والاعضاء ومنع الجفاف من الحيوان.
- معالجة الرحم بعناية عقد بين الإبهام والسبابة وجنين واحد حتى تتحول رأسه مرئيا وموجهة نحو المشغل. تحديد نصفي الكرة الدماغ الانتهائي وحقن واحد منهم من الجانب ظهراني الجانبية. الإفراج 1-2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي باستخدام footswitch من PicoPump حتى يرد البطين بواسطة FastGreen (1B الشكل، والحق).
- عندما يتم حقن جميع الأجنة وelectroporated، ضع الرحم مرة أخرى إلى تجويف البطن وإغلاق الجدران العضلات مع سلسلة خياطة خياطة كل مم 3-4. يجب أن تكون عقدة دافئ إلى العضلات ولكن ليس ضيقا جدا للسماح تورم قليلا من الأنسجة. وأخيرا، أغلق الجلد المغطي باستخدام مقاطع معدنية. تطهير الجلد مع Betaisodona، إزالة الماوس من قناع isoflurane وتحويلها في قفص الإسكان عندما مستيقظا تماما. رصد الانتعاش من الماوس حتى السلوك الحركي أمر طبيعي.
2. تجهيز سامPLE
- واحد أو أكثر يوما بعد الصعق الكهربائي والتضحية الماوس، وجمع الأجنة وتحديد تلك electroporated بشكل صحيح باستخدام stereomicroscope الفلورسنت (1D الشكل). تشريح أدمغة على الجليد الباردة PBS، بين عشية وضحاها واصلاحها في PFA 4٪ (الرقم الهيدروجيني في بارافورمالدهيد العازلة الفوسفات 7.4). في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية وانتشار الخلايا 3.
- ثم تتم معالجة أدمغة لتقطيع والمناعية للعلامات عدة من الخلايا الدبقية شعاعي، أسلاف الخلايا العصبية القاعدية و(Pax6، Nestin، Tbr2، Tbr1، Tuj1 الخ) لتقييم تأثير الجينات المحورة وظيفية على NSC المستهدفة والتي هي ذرية التي حددها التعبير عن الجينات مراسل شارك في electroporated.
الشكل 1.الصعق الكهربائي في الرحم. (A) تمثيل تخطيطي لمنصة الصعق الكهربائي في الرحم. (B) رسومات تبين المواقع من خلال عملية جراحية الماوس الحوامل (يمين) وحقن الخليط DNA / FastGreen (الأزرق) في نصف الكرة الدماغ الانتهائي من جنين أحد الفئران (يسار). (C) مخطط يبين وضع الأقطاب على اتصال مع جدران الرحم مع القطب الموجب (+) المجاورة لمكان الحقن (الأزرق). تبين الأسهم هجرة DNA نحو القطب الموجب. (D) صورة لساعة الماوس الجنين بعد 24 الصعق الكهربائي مع البلازميدات GFP في يوم الجنينية 13. خط متقطع ترسم نصف الكرة الدماغ الانتهائي. مخطط في A 17 2004 معدلة من Calegari وآخرون،.
الجزء 2: توسيع مجلس الأمن القومي الكبار
1. إنتاج جزيئات فيروسية فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة من
- يوم 1: لوحة 5 × 10 6 خلايا 293T على 10 سمطبق مع 8 مل من D-MEM تحتوي على 10٪ من مصل الجنين البقري الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا (مستنبت). استخدام 15 أطباق لمدة إعداد الفيروسية والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- يوم 2: لكل طبق، تمييع في 1 مل من السهل 5 D-ميكروغرام لكل MEM من 3 البلازميدات ترميز لط) VSVG البروتين المغلف (حويصلي نوع الفيروس التهاب الفم G)، والثاني) هفوة / POL (مجموعة محددة مستضد / البلمرة) ، والثالث) لبناء متعدد المقارين التعبير عن الجينات المحورة وظيفية مراسل (أي cdk4/cyclinD1/GFP) المستنسخة من قبل في نقل فيروس نقص المناعة البشرية ناقل القائم (p6NST90) 9. خلط هذا الحل مع 1 مل من D-MEM تحتوي على 45 ميكرولتر من polyethylenimine الذي تم حله قبل في PBS في 1 ملغ / مل محلول المخزون، واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، إزالة وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة 4 مل لكل طبق من جديد D-MEM تحتوي على 15٪ من مصل بقري جنيني الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا. إضافة م 2لتر من خليط ترنسفكأيشن وبين عشية وضحاها الثقافة.
- خلط إضافة 120 ميكرولتر من 500 ملم في طبق لتعزيز التعبير عن الجينات المحورة نا بوتيرات، بلطف والثقافة لمدة 6-8 ساعة بعد ذلك استبدال المتوسطة ترنسفكأيشن مع 5 مل من مستنبت: اليوم 3.
- اليوم 4: جمع supernatants (حوالي إجمالي مل 70)، لتمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون ونقل أنابيب الطرد المركزي في 2 polyallomer (35 X 89 ملم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، إضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. إعادة تعليق بيليه وتحويلها في واحدة polyallomer أنبوب الطرد المركزي (14 × 95 مم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، جعل 5 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية. وسوف يكون عيار الفيروسية في حدود 10 8 وت 9 -10 / مل. (ملاحظة: الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة والتخزين، AVOمعرف إعادة تجميد، والحفاظ على الثلج الجاف أثناء النقل وذوبان الجليد قريبا قبل الاستخدام.)
2. التجسيمي الحقن
- تخدير ماوس 6-10 أسابيع من العمر مع isoflurane ووضع الحيوان في موقف المعرضة على إطار التجسيمي (الشكل 2A) باستخدام قضبان الأذن والحنك الدعم لإصلاح صحيح الرأس. يتم الاحتفاظ الحيوانات الحارة على وسادة التدفئة وضعت في C ° 37 وتحت إدارة isoflurane ثابتة.
- حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من محلول البوبرينورفين يعمل وقائية مسكن، يحلق شريط من الجلد على الرأس من الفأرة، وكما هو موضح في desinfect 1.4. باستخدام مشرط، وجعل كاليفورنيا. 1.5 سم طويلة شق طولي على الجلد الرأس كاشفة عن الجمجمة في مستوى خياطة السهمي. سحب الجلد بلطف وتنظيف سطح العظام مع برعم القطن المعقم.
- نصف ملء كوب الشعرية (المواصفات في 1.2) مع زيت البارافين وتركيبها على مضخة حقن إدراجوشعري حتى الدائري الثاني (الشكل 2B). نقل صاحب الشعرية في محور X و Y و Z حتى يتم وضع غيض من شعري على bregma، نقطة بالتزامن بين الغرز السهمي والجانبية (الشكل 2C) (يتم تحديدها مع مساعدة من stereomicroscope)، و إعادة مجموعة X، Y، Z والقيم إلى 0.
- نقل الشعرية مم 1.6 ± في محور ميديو الاطراف (X) ومم -1.9 في المحور الأمامي الخلفي (ص) وبمناسبة العظام باستخدام قلم علامة الجراحية. جعل ثقب من كاليفورنيا. 0.5 مم القطر على الجمجمة باستخدام الحفار الكهربائي مع إيلاء اهتمام لا للاساءة الى الدماغ.
- وضع قطرات 5 ميكرولتر من التعليق الفيروسي (1 قسامة) على قطعة من parafilm توضع على الأذن والحانات immerge غيض من الشعرية في الحبرية. تمتص كاليفورنيا. تعيين 3،5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية باستخدام محقن نانولتر في 55 NL / ثانية. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة مع قطرات تتبخر.
- نقل شعري لموقع سحقن و وتحريكه لأسفل حتى يلامس طرف سطح حنوني. إعادة تعيين قيمة محور ظهراني بطني (ض) إلى 0. عند هذه النقطة، اختراق الأنسجة مع الشعرية ل-1،9 ملم والإصدار 1.5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية بمعدل من 4 NL / ثانية. الانتظار لمدة 2-3 دقائق لتقليل ارتجاعي من الحوض الصغير التعليق الفيروسية المسار الشعري ومن ثم التراجع عن الشعرية. لا يمكن أن يؤديها A الحقنة الثانية في نصف الكرة controlateral.
- خياطة الجلد، تطهير، والسماح للحيوان للتعافي من التخدير كما هو موضح سابقا في لالصعق الكهربائي الرحم (1.8).
الشكل 2. الفيروسية حقن التجسيمي. (A و B) تمثيل تخطيطي للمكونات اللازمة لأداء حقن التجسيمي (A) وحامل تفكيكها الشعرية التي تبين الإدراج من كاليفورنياpillary حتى الدائري الثاني (B). (C) قطع صورة لرئيس الماوس يجمد من قضبان الأذن والدعم الحنك مع الجلد لفضح الجمجمة (من اليسار). التكبير من مربع منقط (يمين) ويبين الغرز الأفقي والسهمي، bregma، ومكان الحقن (دائرة).
3. تجهيز العينة
- واحد لثلاثة أسابيع بعد العدوى، ويروي الماوس مع كاليفورنيا. 100 مل من PFA 4٪، تشريح الدماغ وبعد اصلاحها بين عشية وضحاها في PFA 4٪. في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU و / أو عقار تاموكسيفين قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية ووقف التعبير عن الجينات المحورة الفيروسية يحيط بها المواقع loxP على التوالي 9.
- ويمكن بعد ذلك تتم معالجة الدماغ للالمناعية باستخدام العديد من علامات الجذعية والخلايا والخلايا العصبية الأسلاف (مثل Sox2، GFAP، Nestin، Tbr2، doublecortin، الخ).
Representative Results
- وعموما، الصعق الكهربائي في الرحم ينتج 60-80٪ من الأجنة electroporated عرض تعبير قوي عن الجين مراسل في منطقة واسعة من القشرة الجانبية (الشكل 3A). ويمكن الكشف عن البروتينات الفلورية بسهولة على الأجنة جبل كامل في أقرب وقت 3-6 ساعات بعد الجراحة مع الإشارة امتدت لأكثر من أسبوع واحد. ضمن المنطقة المستهدفة، حوالي 30-50٪ من الخلايا عادة التعبير عن التحوير (s) مع نسبة من الخلايا المشترك، معربا عن اثنين (أو أكثر) شارك في electroporated الجينات المحورة يجري عادة فوق 90٪ (الشكل 3B، اليسار) 6،8 ، 15. في حين يمكن ملاحظة الحد الأدنى من موت الخلايا المبرمج (حوالي 2،0-2،5٪) بعد حوالي 2 ساعة من الصعق الكهربائي، وهذه القيمة تعود إلى مستويات الفسيولوجية (حوالي 0،5-1،0٪) بعد حوالي 6 ساعات (FC، بيانات غير منشورة). نسبة الأجنة أو الفئران الحوامل يموتون بسبب الجراحة عادة لا يكاد يذكر (<5٪). ثم شارك في الصعق الكهربائي مع cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف بنسبة 48 ساعات للتنمية يطلق زيادة في توسيع السلف العصبية بنسبة 30٪ (الشكل 3B، والحق، وC) 15.
الشكل 3. توسيع الأسلاف العصبية من قبل cdk4/cyclinD1 overexpression. (A) الصورة الإسفار من خلال قسم القشرة الجانبية للجنين أحد الفئران بعد 24 ساعة من الصعق الكهربائي مع البلازميدات وGFP RFP الجنينية في اليوم 13. (B) كما في الصور نيون A 48 ساعة بعد الصعق الكهربائي بالتعاون مع البلازميدات cdk4/GFP وcyclinD1/RFP وimmunolabeling للعلامة السلف القاعدية Tbr2. للصحفيين الفلورسنت مع counterstainig دابي (يسار) وTbr2 (يمين) وترد. خطوط يدل على السطح القمي للمنطقة البطين (VZ؛ الخط الأبيض) وحدود المنطقة subventricular (SVZ؛ الصفراء الخطوط المتقطعة). لاحظ زيادة ثيckness من SVZ في الجزء electroporated من القشرة (رؤوس سهام بيضاء) وذلك بسبب زيادة جيل الأسلاف وتوسيع القاعدية بعد overexpression من cdk4/cyclinD1. (C) الكمي لتأثير هو مبين في الحانات B. = SD، P <0.05، ن = 3. يؤخذ الرسم البياني بار في C من لانج وآخرون، 2009 15.
- بعد حقن التجسيمي الفيروسية، كاليفورنيا. 80٪ من الفئران التي تديرها عرض التعبير القوي للجينات منقولة في جميع أنحاء التلفيف المسنن في كلها. ويمكن التعبير GFP التأسيسي للكشف بسهولة على 40 ميكرومتر المقاطع بمجرد 4 أيام بعد الجراحة. على طول محور منقاري إلى الذيلية من التلفيف المسنن، حول 10-30٪ من الخلايا (أي ما يعادل ما مجموعه كاليفورنيا. 10،000-30،000 خلايا) تعبير عن عادة التحوير (ق) (الشكل 4A) 9. نسبة الفئران يموتون بسبب عملية جراحية لا يكاد يذكر (<5٪). ثلاثة overexpression أسبوع من cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف العوامل التي تسبب زيادة في NSC بنسبة تزيد على سنتينطيات (الشكل 4B)، بينما تتناقص تكوين الخلايا العصبية بنسبة 70٪ (الشكل 4C) 9.
الشكل 4. آثار العدوى الفيروسية. (A) 3D اعادة اعمار 7 صور مضان اتخذت من 40 ميكرومتر سميكة أقسام الاكليلية مسلسل (1 كل جمع 6) على طول محور منقاري إلى الذيلية من قرن آمون. GFP + وتظهر الخلايا المصابة (الأخضر)، وتلطيخ دابي النووي (الأزرق) من التلفيف المسنن (أعلى). صور مشرقة من ميدان المقاطع الاكليلية مماثلة لتلك المبينة في A (وسط) والتمثيل 3D (أسفل) من نصف الكرة المخية والحصين كله مع أبرز في pseudocolor الخضراء (معدل من أطلس الدماغ ألين؛ www.brain-map.org ) . الأسهم البيضاء تشير إلى موقع الحقن. الجانبي (L)، منقاري (R)، والدريشار إلى SAL (D) محاور (س، ص، ض وإحداثيات التجسيمي) (الحق). (B و C) نسبة nestin + NSC (B) وDCX + الخلايا العصبية الوليد (C) بين السكان من GFP + الخلايا المصابة 3 أسابيع بعد الحقن التجسيمي من GFP (أبيض) أو cdk4/cyclinD1/GFP الفيروسات (السوداء). قضبان = SD، P <0.005، ن = 3. الرسوم البيانية في B و C مأخوذة من Artegiani وآخرون، 2011.
Discussion
A خطوة حاسمة لفي الرحم الصعق الكهربائي هو نوعية ونقاء DNA منذ الهجرة في الاتجاه أثناء الولادة من الحقول الكهربائية يعتمد على شحنتها. قد بروتوكولات لتنقية DNA التي لا تتضمن إزالة جزيئات مشحونة إضافية، مثل السموم الداخلية، تؤدي إلى إخفاء من التهم DNA الطبيعية السلبية التي تؤدي إلى تسليم الفقراء. ومن الواضح أن لمس الجدران الرحم مع الأقطاب الكهربائية في أقرب مكان ممكن إلى المنطقة لاستهداف تحسين الكفاءة الصعق الكهربائي. نفس القدر من الأهمية هو نوعية الأقطاب المستخدمة لأن هذا أمر أساسي لإيصال المجالات الكهربائية الأمثل. سوف الخدوش الصغيرة غير مرئية بالعين حتى و / أو مخلفات العضوية، مثل آثار مصل، والدهون، وهكذا دواليك، تتراكم حتما مع مرور الوقت مما يؤدي إلى فقدان أقطاب ممتلكاتهم. electropes القديمة و / أو القذرة هي السبب الأكثر احتمالا لانخفاض مفاجئ في الكفاءة والصعق الكهربائي، وبالتالي، يجب أن تكون صeplaced بمجرد لاحظت هذا. في حين بسيطة نسبيا، في الصعق الكهربائي الرحم وعادة ما يتطلب بضعة أسابيع من التدريب من أجل تحقيق نتائج مرضية واستنساخه. هذه التقنية متعددة جدا حيث يمكن تطبيقه، تقريبا، إلى أي جهاز وأنسجة الجنين النامية. بالتأكيد، أجهزة تحتوي على تجويف، مثل الدماغ وتكون سهلة خصوصا لاستهداف والسماح لنسبة عالية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل نظرا لسهولة حقن كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي.
وهناك مشكلة مشتركة تواجه في إعداد حقن الفيروسية التجسيمي هو أن تكون الخلايا المصابة قليل و / أو لاستهداف مناطق غير مرغوب فيها. ويرتبط أساسا المشكلة الأولى مع حقن منخفضة عيار الفيروسات. الخلايا 293T مع انخفاض عدد من الممرات في الثقافة تنمو بشكل أسرع ويؤدي إلى ارتفاع التتر الفيروسية. باستخدام الخلايا أقدم من كاليفورنيا. سوف لا يوصى ب 20 الممرات وسائل ترنسفكأيشن بكفاءة أقل من 80٪ لا ضمان حسنالفيروسية الإنتاج. إعادة تعليق بيليه الفيروسية من الأهمية بمكان أيضا، وتعليق الفيروسية أن تظهر كتل متجانسة والفيروسية التي يمكن أن تسد الشعيرات الدموية يتعين تجنبها. الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة تنخفض والتخزين على المدى الطويل. لهذا الأسباب، مأخوذة تحتاج إلى تخزينها بشكل دائم في C ° -80 ولا يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. حتى في ظل هذه الظروف، يمكن أن يلاحظ انخفاض في الإصابة بعد 6-12 شهرا من التخزين. في مراحل التعلم، فإننا نقترح لاختبار عيار الفيروسية من كل الفيروسية وإعداد للقيام بذلك مرة أخرى بعد التخزين على المدى الطويل. يمكن وجود خلايا المصابة في مناطق غير مرغوب فيها من الدماغ يعتمد على تحديد المواقع دون المستوى الأمثل من رئيس الماوس على الإطار التجسيمي، الأمر الذي يتطلب بعض الممارسة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان عدم الاضرار سطح الدماغ أثناء فتح ثقب في الجمجمة بسبب وإلا فإنه لن يكون من الممكن إعادة تعيين ال 0 بشكل صحيح على سطح حنوني، مما أدى إلى حقن غير دقيقة. الإحداثياتأننا المنصوص عليها في هذا البروتوكول ويشار إلى C57/BL6 الإناث 6-10 أسابيع من العمر ونقترح لهم لتحسين سلالة مختلفة / العمر / الجنس. قد اقتناء هذه التقنية تحتاج إلى مزيد من الوقت من الصعق الكهربائي في الرحم نظرا لأطول مراحل اللازمة لإعداد الفيروسات وتحليل العينات. ونحن نوصي بشدة أن تستخدم فقط بعد الجراحة الماوس الفيروسات وحقن التجسيمي أصبحت موثوقة وقابلة للتكرار. الخطوة الأولى لتحقيق ذلك هي لحقن الأصباغ DNA الخلية نفيذ، مثل هويشت 33342، الموت الرحيم في الفئران وتحليل العقول على الفور.
في الصعق الكهربائي والحقن داخل الرحم الفيروسية التجسيمي هما نظم قوية لحاد والأنسجة تحديدا التلاعب التعبير الجيني داخل الجهاز العصبي المركزي خلال التنمية الثدييات والبلوغ. رغم القيد في استهداف جزء من السكان فقط من الخلايا، وهذه النظم توفر سرعة وسهولة غير مسبوقة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، طن سيما الجيل شاقة وتستغرق وقتا طويلا من الفئران المعدلة وراثيا. لكن على الرغم من هذا التشابه والاختلافات القائمة بين العديد من الطريقتين التي يستحق الذكر. أولا، فيما يتعلق استهداف أنواع مختلفة من الخلايا، في الصعق الكهربائي يؤدي في البداية الرحم إلى ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية السليمة (وتسمى أيضا خلايا الدبقية شعاعي) لأن هذه هي الخلايا الوحيدة ترسيم البطين حيث يتم حقن الحمض النووي. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية، وسوف يتم في وقت لاحق البلازميدات الموروثة من المستهدف، والخلايا الجذعية الأم إلى السلف و / أو الخلايا العصبية مما يؤدي إلى ابنة إعادة توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في جميع أنحاء القشرة بوصفها وظيفة من الزمن. في المقابل، فإن استخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في الدماغ البالغ يؤدي إلى عدوى متزامنة في أي نوع من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية، الأسلاف، وكذلك الخلايا العصبية الخلايا الدبقية الناضجة. من المذكرة، فيما يتعلق باستخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في مقابل الفيروسات القهقرية أكثر شيوعا هو حقيقةوأن التكامل lentiviral تحدث بشكل مستقل عن الدولة الإنقسامية من الخلايا، مما يسمح للاستهداف أيضا، البالغ الخلايا الجذعية هادئة.
الثانية، وثمة فرق آخر هام بين الصعق الكهربائي والعدوى الفيروسية هو أن يتم التوصل إلى عابرة، التعبير episomal من السابق بدلا من دمج لا رجعة فيه DNA في الجينوم من الخلايا المصابة التي حققها هذا الأخير. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية على التوالي، التخفيف من البلازميدات electroporated، وتدهور البروتين cyclinD1 خارج الرحم، سوف تترتب على ذلك في كل دورة الخلية. وهكذا، ظهر توسيع مجلس الأمن القومي أثناء التطور الجنيني إلى الماضي فقط لما يقرب من 15 يوما بينما في الدماغ الكبار وجد هذا التأثير يستمر لعدة أشهر (نتائج غير منشورة).
الثالث، حيث ط) cdk4/cyclinD1 له تأثير أقوى على الخلايا مع أطول G1 والثاني) الأسلاف العصبية التي ارتكبت خلال التنمية لديها دورة الخلية تعدمن الخلايا الجذعية في حين أن العكس صحيح تماما خلال مرحلة البلوغ، تم العثور على بلدينا التلاعب لتحريك التوسع، في المقام الأول، من خلال الخلايا العصبية الأسلاف والتنمية الجذعية خلال مرحلة البلوغ. في كلتا الحالتين تم تحقيقه زيادة في الخلايا العصبية من قبل كل من الأساليب.
يمكنك بسهولة الرابعة، وحقن الفيروسية أن يؤديها، وبتكاثر موثوق، في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ببساطة عن طريق تغيير إحداثيات التجسيمي. في المقابل، قد الاستهداف الدقيق لمناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مثل جذع الدماغ، وتشكيل قرن آمون، أو الحبل الشوكي، عن طريق الصعق الكهربائي داخل الرحم يكون أكثر صعوبة لتحقيق بتكاثر. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن إجراء الحقن التجسيمي على الفئران في أي عمر، ويقتصر الأداء الأمثل للفي الرحم الصعق الكهربائي من نحو E11 E16 ل. وقبل مراحل E11 يتطلب من استخدام الموجات فوق الصوتية المجهر تشتت ارتدادي 18،19 أو طائفة بأكملها الجنينلدى عودتهم نظام 17،20.
في الآونة الأخيرة، وقد تم الترويج اهتماما متزايدا في بيولوجيا الخلية الأساسية للخلايا الجذعية الجسدية بسبب ويعتقد دراستهم والتلاعب الأساسية لتكون الخلية رواية نحو تطوير العلاجات المستندة التجدد. ولا سيما بالنسبة للoverexpression من cdk4/cyclinD1، والبروتوكول يوفر وسيلة لدينا لزيادة transitorily توسيع مجلس الأمن القومي في الجسم الحي (الشكل 3B و 4B وC و C) من أجل زيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الكبار. ونحن نعتقد أن هذه قد تكون مهمة التلاعب في عدد من السياقات المختلفة لفهم أفضل لدور مجلس الأمن القومي في تطور الدماغ والتنمية والتوازن وكذلك مساهمتها في الوظيفة الإدراكية أو الشفاء من الضمور العصبي أو الإصابة.
Disclosures
وقدمت BA FC طلب البراءة تصف التوسع المشروط من الخلايا الجذعية للبالغين الجسدية من قبل cdk4/cyclinD1 الفيروسات (EP 10160288،6).
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مركز العلاج التجديدي، وكلية الطب في دريسدن TU، ومركز البحوث التعاونية DFG SFB655 (A20 الفرعي). وأيد من قبل BA زمالة من برنامج الحفريات-BB، دريسدن. نشكر الدكاترة. نوريكو Osumi، نومورا تاداشي، ديتر كذبة Chichung، ورافي Jagasia للحصول على المشورة الثمينة خلال إنشاء الصعق الكهربائي في الرحم والحقن الفيروسية التجسيمي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||
| Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
| SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature. 441, 1094-1096 (2006).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).
- Lange, C., Calegari, F. Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells. Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Inoue, T., Krumlauf, R. An impulse to the brain--using in vivo electroporation. Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 10, 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. , Suppl 19 Supp. 120-125 (2009).
- Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse. J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).
- Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).
- Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).
- Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors. Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).
- De Pietri Tonelli, D. Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid. Biotechniques. 41, 727-732 (2006).
- Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
- Osumi, N., Inoue, T. G. ene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
