Summary
Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.
Abstract
Microglia são células da linhagem mielóide que residem no sistema nervoso central (CNS) 1. Estas células desempenham um papel importante na patologia de muitas doenças associadas com neuroinflamação tais como a esclerose múltipla (MS) 2. Microglia em um CNS normais expressar macrófagos CD11b marcador e exibem um fenótipo de repouso por expressar níveis baixos de marcadores de activação, tais como CD45. Durante os eventos patológicos no SNC, a microglia tornar-se activado, tal como determinado por supra-regulação de CD45 e outros marcadores 3. Os fatores que afetam microglia fenótipo e funções no sistema nervoso central não são bem estudadas. MicroRNAs (miRNAs) são uma família em crescimento de moléculas conservada (~ 22 nucleótidos de comprimento) que estão envolvidas em muitos processos fisiológicos normais tais como o crescimento e diferenciação celular 4 e patologias tais como a inflamação 5. MiRNAs regular negativamente a expressão de genes alvo determinados por ligação sequências complementares doIR mRNAs e desempenham um papel importante na activação de células imunes inatas incluindo macrófagos 6 e 7 microglia. A fim de investigar miRNA vias mediadas que definem o fenótipo microglial função biológica, e para distinguir microglia de outros tipos de macrófagos, é importante para avaliar quantitativamente a expressão de microRNAs particulares em subconjuntos distintos de CNS residente microglia. Os métodos comuns para medir a expressão de miRNAs no SNC incluem PCR quantitativo a partir de tecido neuronal geral e hibridação in situ. No entanto, PCR quantitativo a partir de homogeneizado de tecido inteiro não permite a avaliação da expressão de miRNA em microglia, que representam apenas 5-15% das células de tecido neuronal. A hibridação in situ permite a avaliação da expressão de microRNA em tipos de células específicos nas secções de tecido, mas este método não é inteiramente quantitativa. Neste relatório nós descrevemos um quantitativo e senstivo método para a detecção de miRNA por PCR em tempo real em microglia isolado a partir de CNS normais ou durante neuroinflamação utilizando encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de ratinho para a MS. O método descrito irá ser útil para medir o nível de expressão de microRNAs em microglia no SNC normais ou durante neuroinflamação associado com várias patologias, incluindo esclerose múltipla, lesão, acidente vascular cerebral traumática, doença de Alzheimer e tumores cerebrais.
Protocol
1. Isolamento da microglia do CNS normais
Isolamento de microglia é realizado como foi descrito anteriormente com modificações 3.
- Preparar instrumentos para dissecção e perfusão: tesouras, pinças, seringa de 10 ml com uma agulha 27G, 15 ml Dounce homogeneizador (Teflon / vidro), 40 uM coador célula de nylon, 40% e 70% de Percoll soluções, 1X PBS.
- Euthanize camundongos por asfixia rápida (privação de oxigênio) em CO 2 e câmera imediatamente transferi-los para a bancada de laboratório para manipulações cirúrgicas e de perfusão.
- Realizar manipulações cirúrgicas (tesouras e pinças de uso e etanol 70% como anti-séptico): cavidade peritoneal aberta, cortar o diafragma, cavidade torácica aberta e cortar o átrio direito com uma tesoura.
- Realizar todo o corpo de perfusão intracardíaca, injetando 10 ml da seringa no ventrículo esquerdo e pressão. Passe 8-10 ml de 1X PBS através da circulação sanguínea no pa lenta e constantece.
- Repita as etapas de 1,2-1,4 para todos os ratinhos no grupo de ratinhos (tipicamente 5-10). Após a perfusão manter rato sobre o gelo até que todos os ratos são perfundidos.
- Após a perfusão de todos os ratos, dissecar o cérebro e medula espinhal. (Opcional: para estudar a expressão de miRNAs em diferentes áreas do cérebro, dissecar essas áreas específicas, tais como cerebelo, etc hipocampo para o grupo de ratos 5-10 e piscina-los juntos para a homogeneização).
- Homogeneizar cérebro e medula espinhal usando 15 ml Dounce homogeneizador. Coloque um cérebro e uma medula espinhal em homogeneizador e adicionar 5 ml de 1X PBS. Execute 10-20 ataques suaves; passar homogeneizado através de filtro de células em 50 ml-tubo cônico e certificado em 2000 rpm em um minuto centrífuga grandes 5-7.
- Descarte cérebro, sobrenadante ressuspenda / homogeneizado medula espinhal de ratos em 2-3 ml 5-7 de Percoll 70% e ml sobreposição 7 de Percoll 40%. Girar a 2000 rpm (sem freio!) Durante 30 minutos.
- Descartar células danificadas / restos de mielina sobre um topo de 70% e recolher monocélulas nucleares de 40% de interface / 70%. Diluir as células recolhidas em pelo menos uma 1:1 com PBS 1X e centrifugação a 2000 rpm durante 5-7 minutos. Ressuspender as células em 0,5 ml de PBS e transferi-los para 1,7 tubo Ependorf ml. Rendimento típico é de ~ 500 x 10 3 de células mononucleares por ratinho, o que daria o número de células microgliais ~ 1x10 6 em 0,5 ml para a preparação das células do cérebro e medula espinhal de 2-3 ratos.
2. Controle da Pureza de Microglia por citometria de fluxo
A coloração com anticorpos é realizada como anteriormente descrito com modificações 7,8.
- Preparar tampão FACS (PBS 1X com FBS 2%), os anticorpos de bloqueio FCR, anti-CD11b - PE, anti-CD45-APC-Cy7 anticorpos, paraformaldeído a 1% em PBS.
- Tomar 50 ul das células a partir do passo de 1,9 e transferi-los para novo tubo Eppendorf 1,7 ml e adicionar 350 uL de tampão de FACS.
- Adicionar ul 5-10 de anti-FCR anticorpos e incubar 10-15minutos em gelo.
- Dividir as células em dois tubos Eppendorf. Adicionar a um tubo de 1 uL de anti-CD11b - PE e 2 ul anti-CD45-APC-Cy7 anticorpos e incubar 10-15 minutos em gelo. Segundo tubo será usado como um controlo negativo para a coloração de anticorpos. Após incubação com os anticorpos adicionar 1 ml de tampão de FACS a ambos os tubos de centrífuga e spin em pequena a 5400 rpm durante 5 min. Depois de girar fixar as células por ressuspensão em 400 uL de paraformaldeído a 1% em PBS e vórtex.
- Realizar análise de citometria de fluxo em citômetro de fluxo (LSR II, BD Biosciences) utilizando BD compubeads (BD Biosciences) para os controles de compensação, como foi descrito 8. Exemplos de preparações positivos e negativos são mostrados na fig. 1a, b.
3. Isolamento de microglia e macrófagos periféricos do SNC inflamadas em modelo do rato de Neuroinflammation
Encefalite auto-imune experimental (EAE) é induzida como foi previamente descritoem nosso trabalho 7; classificação FACS é realizada de forma semelhante ao protocolo publicado 8.
- Induzir EAE por imunização subcutânea com 150 mg MOG 35-55 péptido em 4 mg / ml completa adjuvante de Freund (CFA) no grupo de 5-10 de 8-12 semanas de idade ratinhos C57BL / 6. A toxina da tosse convulsa deve ser dada ip (150 ng / rato) em dia zero e dois dias, após a imunização. Os ratinhos são observados quanto a sinais de doença, começando no dia 10 pós-imunização, e severidade da doença é pontuado numa escala numérica 0-5 como se segue: 0) sem doença; 1) cauda fraco ou pé vacilante, 2) paresia dos membros posteriores; 3) paralisia dos membros posteriores; 4) paralisia posterior e membro anterior e 5) a morte ou eutanásia por razões humanitárias. Ratos no pico da doença (d21 pós-imunização) são utilizados para experiências com pontuação doença típica variando de 1,5 a 2,5.
- Isolamento de células mononucleares a partir de CNS de grupo de ratinhos 5-10 tal como nos passos 1,1-1,4 e corar as células com anticorpos anti-CD11b e anti-CD45 tal como nos passos 2,1-2,4.No passo 2,4 não fixar as células, em vez ressuspender-los em 400 ul de PBS 1X, em vez de paraformaldeído a 1%.
- Separação de células é realizada por FACSAria para populações de CD11b CD45 + de microglia baixa e CD11b + de células CD45 hi (~ 80% deles são macrófagos periféricos e ~ 20% deles são ativados microglia 3; no futuro vamos nos referir essas células como " macrófagos "). Use 1,7 ml Ependorf tubos para coleta das amostras. 300 ul de PBS 1X com 10% de FBS deve ser adicionada aos tubos de recolha, para evitar danos das células ordenados. Exemplos de três populações de microglia, macrófagos e linfócitos são mostrados na fig. 2a com as configurações de classificação apropriados portão mostrados na figura. 2b. Purezas de classificação típicas eram de 98-100%, tal como determinado por reanalisando populações ordenados de microglia (Fig. 2c) e macrófagos (Fig. 2d). Rendimento típico é 20-50 x10 3 para microglia e50-100 x10 3 para macrófagos isolados a partir do grupo de cinco ratinhos.
4. Isolamento de RNA
RNA irá ser isolado utilizando o kit de Mirvana acordo com as instruções do fabricante, com modificações.
- Girar microglia do CNS normais a partir do passo 1.9 ou subconjuntos ordenados de microglia e macrófagos do passo 3.3 em tubos de 1,7 ml Eppendorf a 5400 rpm durante 5-7 minutos em centrífuga pequena, cuidadosamente elimine o sobrenadante e congelar os peletes de células sobre gelo seco. Continuar a etapa 4,2 ou transferir sedimentos celulares congelados a -70 C, onde pode ser armazenado durante 2-3 meses.
- Transferir sedimentos celulares congelados em gelo regular para o descongelamento. Adicione 300 ml de tampão de lise do kit Mirvana e misture delicadamente por pipetagem 5-7 vezes.
- Adicionar 30 ul de Aditivo Homogenato de Mirvana kit, vórtice 30 segundos para misturar, manter em gelo durante 10 minutos
- Adicione 300 ml de ácido-Pehnol: Clorofórmio de Mirvana kit, vortex 30 segundos, rotação de 5 mem a 10.000 rpm em centrífuga pequena.
- Tomar cuidadosamente fase aquosa superior (300 uL) e transferir para outro tubo Eppendorf 1,7 ml, mistura com 375 ul de etanol a 100%, a transferência para o cartucho de filtro a partir de Mirvana kit e centrifugação durante 1 min a 10.000 rpm.
- Descartar flow-through tampão, adicionar 700 uL de solução de lavagem I a partir de Mirvana kit, e centrifugação durante 1 min a 10.000 rpm.
- Lavar duas vezes mais com 500 ul de solução de lavagem II a partir de Mirvana kit e finalmente eluir RNA a partir de cartucho com 60 ul de pré-aquecido a água livre de nuclease.
- A quantidade e qualidade de RNA é avaliada usando espectrofotómetro Nanodrop. A concentração de RNA deve ser de 5 a 20 ng / ml e OD λ260 / λ280 rácio dentro da gama de 1,7-2,0. Se a concentração de RNA é menor do que 3 ng / ml e OD 260λ/280λ é menor do que 1,6, as amostras são descartados. As amostras de RNA pode ser armazenada a -70 ° C durante 6-12 meses.
- Para a estimativa adicional de qualidade de RNA, o ar amostrase analisados usando electroforese em gel de 15% de gel de TBE Ureia-(Life Technologies). Exemplos típicos de boa e má qualidade das preparações de RNA são mostrados na fig. 3a e Fig.3b, respectivamente.
5. A detecção de miRNA em microglia e macrófagos
Para a análise de expressão de miRNA, em tempo real da transcriptase reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) é levada a cabo análises usando ensaios de TaqMan com primers e sondas fluorescentes para microRNA particular de interesse e um dos RNAs ubiquamente expressas curtos (por exemplo, snoRNA-55, snoRNA -135 ou U6) para a normalização. Primers e sondas fluorescentes para conjuntos particulares de miRNA humano ou rato pode ser adquirido a partir de Life Technologies Inc. Aqui usaremos miR-124 como um exemplo para miRNA de interesse e snoRNA-55 como um exemplo para a normalização.
- Realizar inverter reacção de transcriptase para fazer cDNA a partir de amostras de RNA usando TaqMan kit de transcrição reversa:
| Item | Volume (uL) por amostra |
| Primer RT 5x | 1,00 |
| Amostra de RNA | 1,67 |
| RT Mix Enzyme | |
| 25 mM de cada dNTP (total de 100 mM) | 0,050 |
| MultiScribe transcriptase reversa) | 0,333 |
| Tampão RT 10X | 0,500 |
| AB RNase Inibidor | 0,063 |
| Livre de nuclease água | 1,388 |
| Total | 5,00 |
Diluir o RNA amostras a concentração ng 3 / uL. Preparar RT mistura de enzimas e colocar 3,33 uL para tubos de PCR e adicionar 1,67 ul de amostra de RNA. Incubar em PCR Instrumento (BioRad) a 16 ° Cdurante 30 min, 42 ° C durante 30 min, 85 ° C durante 5 min, e definir a 4 ° C em espera.
- Executar em tempo real de reacção de PCR utilizando TaqMan mistura de PCR:
| Item | Volume (uL) por amostra |
| RT produto | 1,0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5,0 |
| Probe 5X | 2,0 |
| Livre de nuclease água | 2,0 |
| Total | 10,0 |
Use uma placa de reação 384-bem claro óptico (Life Technologies) para cada reação e em tempo real instrumento de PCR AB 7900 HT. As condições de amplificação: 95 ° C durante 10 min, [95 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 60 seg x 40 ciclos].
- Curvas típicas para a quantidade de fluorescently rotulado produtos PCR específicos (Y-eixos) para snoRNA-55 e miR-124 para as amostras de RNA (cada amostra é em duplicado) isoladas a partir microglia e macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) versus o número de ciclos (x-eixos) são mostrado na fig. 4a, b.
6. Análise de Dados Normalização e
Os níveis de expressão relativos de miRNA de interesse (MIR-124) são calculados usando o método ΔΔCT como anteriormente descrito utilizando 7,9 snoRNA-55 para a normalização da quantidade inicial de ARN.
- O exemplo de cálculo do nível relativo de miR-124 expressão para microglia e BMDMs é mostrada na Tabela I.
- Como um primeiro passo, os valores para Ct snoRNA-55 e miR-124 são determinados para microglia e BMDMs de qRT-PCR curvas (Fig.4; Tabela I, as colunas: snoRNA-55 e miR-124).
- Como uma segunda etapa, ΔCt valoressão calculados para cada duplicado de cada amostra por subtracção da TC para snoRNA-55 (normalização) de Ct para miR-124 (experiência) (Tabela I, colunas: Ct (Norm), CT (Exp.), e ΔCt).
- Como um terceiro passo. Os valores são calculados ΔΔCt por subtracção do ΔCt da amostra de referência (ΔCt (Ref.)) a partir de valores ΔCt de outras amostras (Tabela I, Coluna: ΔΔCt). Uma amostra é definida como uma referência; o nível relativo de expressão miRNA para esta amostra irá ser definida como 1,0. Todas as amostras de outros serão comparadas com esta amostra de referência. No nosso caso, nós definimos o nível de miR-124 na primeira amostra para microglia como 1,0, portanto ΔCt (Ref) = 0,49 (Tabela I linha, primeiro, marcado em vermelho).
- Finalmente, o nível relativo de expressão é calculado como 2-ΔΔCt (Tabela I, Coluna: miR-124 expression).
- Todos os qRT-PCRs são realizadas em triplicado ou em duplicados, e do nível relativo de expressão é apresentado como média ± desvio padrão (SD) para triplica (Fig. 5a, b) ou como ambos os lados duplica a lado, como mostrado na fig. 5c.
7. Os resultados representativos
As curvas típicas para PCR em tempo real e valores de TC de miR-124 (microRNA de interesse) e snoRNA-55 (normalização), bem como os níveis relativos de expressão de miR-124 são mostrados na fig. 4 e na Tabela I. Nas nossas experiências utilizou-se snoRNA-55 como um controlo para a normalização. Como mencionado acima, outros RNAs ubíquos pode ser também utilizado para a normalização, tais como snoRNA-135 e U6.
Os exemplos de a expressão de miR-124 em adultos microglia vs de medula óssea (macrófagos derivados BMDMs) são mostrados na fig. 5a (BMDMs foram cultivadas na presence de M-CSF, tal como descrito 7). Na fig. 5b, comparamos a expressão de miR-124 em populações classificadas de CD45 microglia baixo vs CD45 hi macrófagos. Em ambos estes experimentos demonstrou-se que a microglia são diferentes dos outros macrófagos expressando níveis mais elevados de miR-124. Experiências semelhantes podem ser realizadas no futuro para a cinética da microglia activação in vivo ou in vitro.
Expressão de miR-124 em microglia isolado a partir de CNS de ratinhos C57BL / 6 em diferentes estádios de desenvolvimento é mostrado na fig. 5c. Estes dados demonstram que a microglia em estágios iniciais de desenvolvimento expressa baixos níveis de miR-124, que se correlacionou com seu fenótipo ativado 7. Análise semelhante pode ser realizada para estudar as funções de microglia no SNC normais, tais como comparação da expressão de miRNAs particulares em microglia isoladas a partir de diferentes áreas do SNC: o cerebelo, scabo de Pinal, etc hipocampo
Figura 1. Os exemplos de preparações bons e ruins de microglia, conforme determinado por citometria de fluxo. No caso de isolamento "bom" da microglia do SNC normais, 95-98% das células CD45 + CD11b representam microgla baixo com 2-5% de CD11b + CD45 hi macrófagos perivasculares. Menos de 1% de CD11b - CD45 linfócitos hi ou CD11b - CD45 - células astrogliais ou oligodendroglial ou fragmentos de células deve estar presente (a). O caso da preparação "ruim" é mostrado aqui (b) onde 18% de contaminação CD11b - CD45 - células está presente (b, quadrante inferior esquerdo), sugerindo separação por gradiente de Percoll insuficiente. No caso de uma boa preparação, 95-98% das células deve representar CD11b + CD45baixa microglia (a, quadrante superior esquerdo), 2-5% de todas as células devem representar CD11b + de CD45 macrófagos hi perivascular (um, no quadrante superior direito), e menos de 1% de todas as células devem representar CD11b negativos células contaminantes (um, quadrante inferior esquerdo). No caso de «preparação mau", a contaminação significativa do CD11b - CD45 - células ou fragmentos celulares (astroglia, as partículas de mielina etc) estão presentes (b, quadrante inferior esquerdo), o que torna a preparação das células impróprios para RNA de isolamento e ainda mais análise. Além disso, CD11b - células CD45 hi poderiam também estar presentes, no caso de "preparação mau" (b, quadrante inferior direito), indicando a contaminação por linfócitos de sangue devido à perfusão insuficiente.
Figura 2. Citometria de fluxo Analysis e triagem de populações de microglia e macrófagos periférico de doentes CNS (a) Durante neuroinflamação três populações das células estão presentes no SNC: CD11b + CD45 baixa (microglia), CD11b + de CD45 Hi (macrófagos), e CD11b - CD45. oi (linfócitos), como mostrado no canto superior direito, superior esquerdo e inferior quadrantes direita, respectivamente. Portas para classificar as populações de CD11b + CD45 baixo microglia e CD11b + de CD45 macrófagos hi são mostrados em (b), e as purezas de populações reanalisaram classificadas são mostrados em (c, d). Gating preliminar sobre as células viáveis com base na FSC / SSC parâmetros foi implementado.
Figura 3. Exemplos de qualit "bom" e "ruim"s de RNAs isoladas de microglia e analisado por electroforese em gel. No caso de boa qualidade, o RNA escada e RNA ribossomal é evidente (a). No caso de má qualidade, manchas e de baixo custo produtos de degradação de peso molecular são evidentes (b).
Figura 4. Em tempo real qRT-PCR curvas para marcado por fluorescência miR-124 e dos produtos snoRNA-55 de PCR. Curvas para snoRNA-55 (a) e miR-124 (b) são mostrados para microglia e de medula óssea (macrófagos derivados BMDMs). O experimento foi realizado em duplicata. Valores Ct foram determinados pela intersecção da linha de base com a parte inferior da gama linear da curva qRT-PCR como mostrado em (b). para ver figura maior .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = Ct (Exp)-Ct (Norm) | DDCT = DCT-DCT (Ref) | Nível relativo de Expressão = 2-DDCT | |
| Ct (Norm) | Ct (Exp) | DCT | DDCT | miR-124 Expressão | |
| Micróglia do SNC normais | 24,082 | 24,572 | 0,49 (Ref.) | 0 | 1,0 |
| 23,766 | 24,291 | 0,525 | 0,035 | 1,02 | |
| De medula óssea (macrófagos derivados BMDMs) | 26,879 | 320,231 | 5,352 | 5,317 | 0,025 |
| 26,526 | 32,078 | 5,552 | 5,517 | 0,022 |
Tabela de Cálculo I. dos níveis relativos de miR-124 expressão em macrófagos microglia vs derivadas da medula óssea com base dos valores C t de miR-124 (microRNA de interesse) e snoRNA-55 (controle de normalização).
Figura 5. Análise de miR-124 expressão em microglia e macrófagos. Comparação de miR-124 expressão em microglia do CNS normais versus macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) é mostrado em (a). Comparação de miR-124 em microglia vs macrófagos periférico isolado a partir de CNS de em ratinhos com neuroinflamação é mostrado em (b). As alterações nanível de expressão de miR-124 em microglia durante o desenvolvimento em ratinhos de 1, 2 e 4 semanas de idade, quando comparado com ratinhos adultos (com 8 semanas de idade) é mostrado em (c). Em (a, b) a experiência foi realizada em triplicado com média ± DP de três reacções separadas PCR mostrado. Em (c) experiência foi realizada em duplicado tal como indicado.
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Discussion
Recentemente interesse significativo foi dado a microglia e envolvimento destas células em muitas patologias associadas com neuroinflamação e neurodegeneração. Além disso, o papel de microRNAs na diferenciação de células imunes e cancro dramaticamente aumentado ao longo dos últimos 5,10 vários anos. Nós previamente relatado o papel de miR-124 na manutenção do fenótipo não-activado ou de repouso da microglia no CNS normais 7, mas o papel dos outros tipos de microRNAs em microglia fenótipo e estado de activação continua a ser descobertos. Isto exigirá o desenvolvimento de novos métodos para medir a expressão de miRNA especificamente em microglia.
Microglia são células difíceis de lidar em experimentos, uma vez que tornam-se ativados e significativamente alterada após o seu isolamento do SNC. Os protocolos para isolamento de microglia do SNC normais foram previamente publicados 11,12. Embora estes protocolos coulseria útil para o isolamento de RNA, acreditamos que estes protocolos são mais adequados para a expressão do mRNA em vez de para a avaliação da expressão microRNA. Primeiro, muitos pesquisadores usam digestão enzimática do tecido homogeneizado ou purificação grânulo magnético que ativar a microglia e resultar em mudanças significativas na expressão de microRNA (não publicado de observação). Em segundo lugar, os autores utilizam Trizol métodos baseados para RNA de isolamento 11, que não é o ideal para a análise de microRNA em um pequeno número de células microgliais, especialmente para as populações que foram classificadas de CNS por FACS. Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápida com o mínimo de manipulações durante o isolamento de microglia do sistema nervoso central. Este método permite a recepção de populações puras de microglia com níveis mínimos de activação espontânea combinada com uma técnica para o isolamento eficaz de RNA a partir de um pequeno número de células. Além disso, utilizou-se o protocolo para o isolamento de RNA que será particularmente enriquecidocom pequenos RNAs não-codificantes e microRNA.
Além da pureza do isolado microglia, também é importante ter a certeza de que a qualidade de RNA é adequado. Sem a separação adequada de microglia do gradiente de Percoll, o resultado é a contaminação de amostras de RNA com detritos de mielina, o que tornaria perfis miRNA na microglia não só difícil de interpretar, mas também diminui a qualidade do RNA em vez drasticamente devido a uma alta concentração de ácidos nucléicos, proteínas e lipídios em partículas de mielina.
Como mencionado acima, a dificuldade em medir uma substancial expressão miRNA na microglia é o pequeno número de células e baixa quantidade de ARN obtida mesmo a partir de um grande grupo de ratinhos (10 ou mais). Por isso, recomendo fazer uma pequena lista de 10-30 microRNAs e olhar separadamente ao nível de expressão de cada um usando uma singleplex qRT-PCR em vez de usar ensaios multiplex menos sensíveis de PCR ou matrizes queexigir uma quantidade bastante elevada de RNA. Após a avaliação da expressão de vários microRNAs por singleplex qRT-PCR como descrito, outros métodos de perfil em grande escala miRNA poderia ser utilizado após a sua validação cuidadosa. Recentemente, houve uma reportagem sobre um método mais sensível para a análise multiplex de microRNAs em plataformas microfluídica 13, que potencialmente poderiam ser adotados para a grande escala de perfil de expressão de microRNA em microglia.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho foi suportado pelo NIH R01 NS071039-01A1 bolsa de investigação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
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