Summary
Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.
Abstract
Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) 1 ikamet miyeloid soyunun hücrelerdir. Bu hücreler multipl skleroz (MS) 2 gibi nöro-inflamasyonu ile ilişkili birçok hastalık patolojileri önemli bir rol oynamaktadır. Normal bir MSS mikroglia makrofaj belirteç CD11b ifade ve böyle CD45 olarak aktivasyonu düşük seviyelerde ifade ederek dinlenme fenotip sergilerler. MSS patolojik olaylar sırasında, mikroglia CD45 upregülasyonunun ve diğer belirteçler 3 olarak belirlenmiştir aktive olur. Mikroglia fenotip ve MSS işlevlerini etkileyen faktörler iyi çalışılmıştır değildir. MicroRNA (miRNA'lar) gibi hücre büyümesi ve farklılaşması 4 ve inflamasyon 5 gibi patolojiler gibi birçok normal fizyolojik süreç olarak katılıyor korunmuş molekülleri (~ 22 nükleotid uzunluğunda) büyüyen bir aileyiz. MiRNA'lar bağlayıcı tamamlayıcı dizileri tarafından belli bir hedef genlerin ifade downregulateir mRNA'ların ve makrofajlar 6 ve mikroglia 7 de dahil olmak üzere doğal bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglial fenotipi, biyolojik işlevini tanımlamak ve makrofajların diğer türlerinden mikroglia ayırmak için miRNA aracılı yollarının araştırılması amacıyla, kantitatif MSS yerleşik mikroglia farklı alt grupları özellikle microRNA ifade değerlendirmek için önemlidir. MSS kullarak ölçmek için ortak yöntemler tüm nöronal doku ve in situ hibridizasyon kantitatif PCR içerir. Ancak, bütün doku homojenattan kantitatif PCR nöronal doku hücrelerinin sadece% 5-15 temsil mikroglia miRNA ifadesi değerlendirilmesi, izin vermez. In situ hibridizasyon doku bölümlerini özel hücre tipleri içinde mikroRNA ile ifade değerlendirmesi sağlar, fakat bu yöntem tamamen niceliksel değildir. Bu yazıda, niceliksel ve sens tarifNormal MSS veya deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE), MS için fare modeli kullanılarak nöro-inflamasyonu sırasında izole mikroglia gerçek zamanlı PCR ile miRNA tespiti için itive yöntemi. Açıklanan yöntem, normal MSS veya MS, inme, travmatik yaralanma, Alzheimer hastalığı ve beyin tümörleri gibi çeşitli patolojiler ile ilişkili nöro-inflamasyonu sırasında mikroglia içinde microRNA ifade düzeyini ölçmek için yararlı olacaktır.
Protocol
1. Normal CNS den mikroglia İzolasyonu
Mikroglia izolasyonu modifikasyonlar 3 ile daha önce tarif edildiği gibi yapılabilir.
- Makas, forseps, 27g iğne, 15 ml Dounce homojenizör (Teflon / cam), 40 mikron naylon hücre süzgecinden,% 40 ve% 70 Percoll çözümleri, 1X PBS ile 10 ml şırınga: diseksiyonu ve perfüzyon aletleri hazırlayın.
- CO 2 kamera hızlı boğulma (oksijen eksikliği) tarafından fareler Euthanize ve hemen cerrahi manipülasyon ve perfüzyon için laboratuar tezgah aktarabilirsiniz.
- Cerrahi manipülasyonlar (kullanım makas ve forseps ve antiseptik olarak% 70 etanol) gerçekleştirin: açık periton boşluğu, diyafram, açık göğüs boşluğu kesilir ve makas ile sağ atrium snip.
- Sol ventrikül içine 10 ml şırınga enjekte ve basınç uygulayarak tüm vücut intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin. Yavaş ve sürekli hasta olarak kan dolaşımı yoluyla 1X PBS 8-10 ml iletince.
- Tekrar grubundaki tüm farelerde (genellikle 5-10 fare) için 1,2-1,4 adımları yineleyin. Tüm fareler perfüze kadar perfüzyon sonra buz üzerinde fare tutun.
- Tüm farelerin perfüzyon sonra, beyin ve omurilik incelemek. (Opsiyonel: beynin farklı bölgelerinde miRNA'lar ifade incelemek gibi beyincik, 5-10 fareler ve homojenizasyon için birlikte havuzu bunlardan grubu için hipokampus gibi bu belirli alanlarda teşrih).
- 15 ml Dounce homojenizatör kullanarak beyin ve omurilik homojenize edilir. Yer bir beyin ve omurilik bir homojenizatör içinde ve 1X PBS 5 ml ilave edilir. 10-20 nazik grev gerçekleştirme; büyük bir santrifüj 5-7 dakika 2000 rpm'de 50 ml konik tüp ve sertifikaya hücre süzgecinden Homojenat geçmektedir.
- Percoll% 70 ve% 40 Percoll bir bindirme 7 ml 5-7 ml 2-3 farelerin süpernatan, Pastör pipetiyle beyin / omurilik Homojenat atın. 30 dakika 2000 rpm (yok fren!) Dönerler.
- % 70 üstünde hasarlı hücreleri / miyelin enkaz atın ve mono toplamak% 40 /% 70 arayüzü nükleer hücreler. En az 5-7 dakika süreyle 2000 rpm'de 1X PBS ve spin ile 1:1 toplanan hücreler sulandırınız. PBS 0.5 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve 1.7 ml ependorf tüp içine aktarabilirsiniz. Tipik verim beyinleri ve 2-3 farelerin omurilik gelen hücrelerinin hazırlanması için mikrogliyal hücrelerin sayısını ~ 0.5 ml 1x10 6 verecek fare başına mononükleer hücrelerden, bir ~ 500 x 10 3 'dir.
2. Akım Sitometri tarafından mikroglia Saflık Kontrolü
Daha önce modifikasyonlar 7,8 ile tarif edildiği gibi antikorları ile lekelenmesi gerçekleştirilir.
- PE, anti-CD45-APC-Cy7 antikorlar, PBS içinde% 1 paraformaldehid - FACS tamponu (% 2 FBS ile 1X PBS), bloke edici FCR antikorları, anti-CD11b hazırlayın.
- Adımda 1.9 ila hücrelerin 50 ul alın ve yeni 1.7 ml Eppendorf tüpüne aktarabilir ve FACS tampon 350 ul ekleyin.
- Anti-FCR antikorların 5-10 ul ekleyin ve 10-15 kuluçkayabuz üzerinde dakika.
- Iki Eppendorf tüplerine hücreleri bölme. Bir tüp ile 1 anti-CD11b ul ekle - PE ve 2 ul anti-CD45-APC-Cy7 antikorlar ve buz üzerinde 10-15 dakika beklettikten sonra kullanın. Ikinci tüp antikor boyama için bir negatif kontrol olarak kullanılacaktır. Antikorlarla inkübasyon 5 dakika 5400 rpm'de santrifüj küçük iki tüpe ve spin için FACS tampon 1 ml ekledikten sonra. Iplik sonra PBS ile vorteks içinde% 1 paraformaldehid ile 400 ul bunları resuspending tarafından hücreleri sabitlemek.
- 8 tarif edildiği şekilde tazminat kontrolleri için BD compubeads (BD Biosciences) kullanılarak akış sitometresi (LSR II, BD Biosciences) üzerinde akım sitometri analizi yapın. Iyi veya kötü preparatlar örnekler Şekil 'de gösterilmiştir. 1a, b.
3. Nöro ve Fare Modelinde Iltihaplı CNS den mikroglia ve Periferik Makrofajlar İzolasyonu
Daha önce tarif edildiği gibi deneysel otoimmün ensefalit (EAE) indüklenirBizim kağıt 7'de; FACS sıralama yayınlanan protokolü 8 benzer şekilde gerçekleştirilir.
- 150 mg 8-12 haftalık C57BL / 6 fare 5-10 grubu, 4 mg / ml tam Freund yardımcı maddesi (CFA) içinde 35-55 peptid MOG ile subkutan immünizasyonu ile EAE indüklemek. Boğmaca toksin gün sıfır ile gün iki sonrası bağışıklama ip (150 ng / fare) verilmelidir. Fareler 10. günde sonrası bağışıklama başlayan hastalık belirtileri görülür, ve aşağıdaki gibi hastalık şiddeti 0-5 arası sayısal bir ölçekte atılırsa: 0) hiçbir hastalık; 1) zayıf kuyruk ya da titrek bir yürüyüş; 2) arka bacak parezi; 3) arka bacak felci; 4) arka ve ön uzuvların felç ve 5) ölüm ya da insani nedenlerle ötenazi. Hastalığın zirvesinde Fare (d21 sonrası bağışıklama) 1.5 ila 2.5 arasında değişen tipik hastalığı puanı ile deney için kullanılır.
- Adımları 1,1-1,4 gibi 5-10 farelerin grubunun merkezi sinir sistemi ile mononükleer hücreler izole etmek ve adım 2,1-2,4 gibi anti-CD11b ve anti-CD45 antikoru ile birlikte hücreleri leke.Adım 2.4 1X PBS yerine% 1 paraformaldehid 400 ul onları tekrar süspansiyon yerine, hücreleri düzeltmek yok.
- Gelecekte biz de bu hücrelerin sevk edecektir "; Hücre sıralama CD11b nüfusları + CD45 düşük mikroglia ve CD11b + CD45 hi hücreleri (bunların ~ 80% periferik makrofajlar ve ~ bunların% 20 mikroglia 3 aktive için FACSAria tarafından yapılır makrofajlar "). Numunelerin toplanması için 1.7 ml ependorf tüpleri kullanın. % 10 FBS ile 1X PBS 300 ul sıralanmış hücrelerin zarar görmesini önlemek için toplama tüpleri eklenmelidir. Üç mikroglianın popülasyonları, makrofajlar, lenfositler ve örnekler şekil gösterilmektedir. Şekil doğru sıralama kapısı ayarları ile 2a. 2b. Sıralanmış mikroglia popülasyonları (Şekil 2c) ve makrofajlar (Şekil 2d), lisansüstü eğitim ile belirlenen tipik sıralama saflık 98-100% idi. Tipik verim mikroglia için x10 3 20-50 veBeş fare grubu izole makrofajlar için 50-100 x10 3.
4. RNA'nın izolasyonu
RNA modifikasyonları olan üreticinin talimatlarına uygun olarak Mirvana kit kullanılarak izole edilir.
- Dikkatli Süpernatant atmak ve kuru buz Hücre pelletleri dondurmak, adım 1.9 veya mikroglia ve küçük santrifüj 5-7 dakika süreyle 5400 rpm'de 1,7 ml Eppendorf tüpleri adım 3.3 den makrofajların sıralanmış alt normal CNS den mikroglia Spin. 4.2 basmayın veya 2-3 ay saklanabilir -70 C, dondurulmuş hücre pelletleri aktarmak geçin.
- Eritmek için düzenli buz dondurulmuş hücre pelletleri aktarın. Mirvana kiti Lizis tampon 300 ul ekleyin ve yavaşça 5-7 kez pipeting ile karıştırın.
- , Karıştırıp 10 dakika buz üzerinde tutmak için Mirvana kiti, girdap 30 saniye arasında homojenatında Katkı 30 ul ekle
- 5 m için Mirvana kiti, girdap 30 saniye, dönüş sonrası Kloroform: Asit-Pehnol 300 ul ekleküçük santrifüj 10.000 rpm'de.
- Dikkatle üst sulu faz (300 ul) alıp onu başka 1,7 ml Eppendorf tüp,% 100 etanol 375 ul karışımı aktarmak, 10,000 rpm'de 1 dakika Mirvana kiti ve spin ile kartuş filtre transfer.
- Atın akış yoluyla tampon, Yıkama çözüm Mirvana kiti Ben ve 10.000 rpm'de 1 dakika için spin 700 ul ekleyin.
- Mirvana kiti Yıkama çözüm II 500 ul iki kez daha yıkayın ve sonunda önceden ısıtılmış nükleaz içermeyen su 60 ul kartuş RNA Zehir.
- RNA miktarı ve kalite Nanodrop spektrofotometresi kullanılarak ölçülür. RNA konsantrasyonu 5 ila 20 ng / ml ve OD λ260 / aralığı içinde λ280 1,7-2,0 oranında olmalıdır. RNA konsantrasyonu ng / ml ve OD 260λ/280λ 1.6 'den daha düşük olan 3' den daha düşük ise, örnek atılır. RNA örnekler 6-12 ay boyunca -70 ° C'de saklanabilir.
- RNA, numuneler ar kalitesi daha da tahmin etmek içine% 15 TBE-Üre Jel (Life Technologies) jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi. RNA preparatların iyi veya kötü kaliteli Tipik örnekler Şekil 'de gösterilmiştir. , Sırasıyla 3a ve Fig.3b,.
5.. Mikroglia ve Makrofajlar miRNA tespiti
MiRNA ifade analizi için, gerçek zamanlı kantitatif ters transkriptaz PCR (QRT-PCR) ve flüoresan analiz primerler probları özellikle ilgi mikroRNA ve her yerde eksprese kısa RNA'lar biri (örn. snoRNA-55, snoRNA ile TaqMan deneyleri kullanılarak gerçekleştirilir normalleşmesi için -135 veya U6). Insan veya fare miRNA belirli setleri için Astarlar ve flüoresan millerini Burada normalleşmesi için bir örnek olarak ilgi ve snoRNA-55 miRNA için bir örnek olarak miR-124 kullanacaktır Life Technologies Inc satın alınabilir.
- TaqMan ters transkripsiyon kiti kullanılarak RNA örneklerinden cDNA yapmak transkriptaz reaksiyon ters gerçekleştirin:
| Madde | Numune başına Hacmi (ul) |
| 5x RT Astar | 1.00 |
| RNA örneği | 1.67 |
| RT Enzim Mix | |
| 25 mM her biri (100 mM toplam) dNTP | 0.050 |
| Reverse Transcriptase MultiScribe) | 0.333 |
| 10X RT Tampon | 0.500 |
| AB RNaz İnhibitör | 0.063 |
| Nükleaz-serbest su | 1.388 |
| Toplam | 5.00 |
Konsantrasyonu 3 ng / ml için örnekleri RNA sulandırınız. RT Enzim Mix hazırlayın ve PCR tüpleri için 3.33 uL koymak ve RNA örnek 1.67 ul ekleyin. 16 ° C'de PCR Aracı (BioRad) içinde inkübe30 dakika, 42 ° C'de 30 dakika, 85 ° C'de 5 dakika, ve ° C beklemeye 4 olarak belirlenmiştir için için.
- TaqMan PCR karışımı kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin:
| Madde | Numune başına Hacmi (ul) |
| RT ürün | 1.0 |
| 2X TaqMan Master Mix | 5.0 |
| 5X Prob | 2.0 |
| Nükleaz-serbest su | 2.0 |
| Toplam | 10.0 |
Her reaksiyon ve real-time PCR cihazı AB 7900 HT, 384-de net optik reaksiyon plaka (Life Technologies) kullanın. Bisiklet koşulları: 95 ° C'de 10 dakika süre ile, [95 ° C'de 5 sn 60 ° C de 60 sn] x 40 döngü.
- Fluo miktarı tipik eğrilerirescently mikroglia ve kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) vs döngü sayısı (x-ekseni) izole edilen RNA numuneleri (her bir örnek çiftleri olduğu) için snoRNA-55 ve miR-124 özgü PCR ürünleri (y-ekseni) edilir etiketli Şek. 4a, b.
6. Normalizasyon ve Veri Analizi
Ilgi miRNA (MIR-124) için bağıl ifade seviyelerinin, daha önce RNA'nın başlangıç miktarı normale snoRNA-55 kullanılarak 7,9 tarif edildiği gibi ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplanır.
- Mikroglia ve BMDMs için miR-124 bağıl ifade seviyesinin hesaplama örneğin Tablo I 'de gösterilmiştir.
- İlk adım olarak, snoRNA-55 ve miR-124 için Ct değerlerini QRT-PCR eğrilerinden mikroglia ve BMDMs için belirlenir (Şekil 4, Tablo I, sütunlar: snoRNA-55 ve miR-124).
- İkinci adım olarak, ΔCt değerlerimiR-124 (deney) (: Ct (Norm), Ct (Exp) ve ΔCt Tablo I, sütun) için Ct gelen snoRNA-55 (normalleştirme) için Ct çıkarılması ile her numunenin her yinelenen için hesaplanmıştır.
- Üçüncü bir adım olarak. ΔΔCt değerleri diğer örnekler (: ΔΔCt Tablo I, sütun) ΔCt değerleri referans örnek ΔCt çıkarılması (ΔCt (Ref)) hesaplanır. Bir örnek, bir referans olarak tanımlanır; Bu örneğin miRNA ifade seviyesinde 1,0 göreceli olarak tanımlanacaktır. Diğer tüm örnekler bu referans numuneye göre yapılacaktır. Bizim durumumuzda, biz 1.0 olarak mikroglia için ilk örnek miR-124 düzeyini tanımlamak, bu nedenle ΔCt (Ref) = 0.49 (kırmızı olarak işaretlenmiştir Tablo I, ilk satır).
- MiR-124 e: Son olarak, ifade seviyesinde nispi 2-ΔΔCt (Tablo I, sütun olarak hesaplanırXPression).
- Tüm QRT-PCR kopyaların veya çoğaltmaları yapılmaktadır, ve ifade göreli düzeyi ortalaması olarak sunulmuştur ± (Şekil 5a, b) kopyaların veya Şekil olarak yan yana iki kopyası olarak standart sapma (SD). 5c.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Gerçek zamanlı PCR ve CT değerleri miR-124 (ilgi mikroRNA) ve snoRNA-55 (normalizasyon) yanı sıra miR-124 bağıl ifade seviyeleri için tipik eğrileri Şekil 'de gösterilmiştir. 4 ve Tablo. Deneylerde biz normalleşmesi için bir kontrol olarak snoRNA-55 kullanılır. Yukarıda da belirtildiği gibi, başka bir yerde RNA'lar ayrıca snoRNA-135 ve U6 olarak normalizasyon için de kullanılabilir.
Yetişkin mikroglia vs kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) içinde miR-124 ifade örnekler Şekil 'de gösterilmiştir. 5a (BMDMs presenc yetiştirildiM-CSF e) 7 nitelendirdi. Şek. 5b, biz CD45 düşük mikroglia vs CD45 hi makrofajların sıralanmış popülasyonlarında miR-124 ifadesi karşılaştırıldı. Bu deneylerin hem de bu mikroglia miR-124 daha yüksek seviyelerde ifade tarafından makrofaj, diğer farklı olduğunu göstermiştir. Benzer deneyler, in vivo veya in vitro mikroglia aktivasyonu kinetiği için gelecekte gerçekleştirilebilir.
Gelişme çeşitli aşamalarda, C57BL CNS / 6 fare izole mikroglia in miR-124 ekspresyon Şek. 5c. Bu veriler onların aktif fenotipi 7 ile korelasyon daha düşük geliştirme ekspres miR-124 düzeyleri, erken aşamalarında olduğunu mikroglia göstermektedir. Serebellum, s: Benzer analizi gibi MSS farklı bölgelerinden izole mikroglia özellikle miRNA'lar ifade karşılaştırılması normal MSS mikroglia fonksiyonlarını incelemek için yapılabilirPinal kablosu, hipokampus vb
Şekil 1.. Akış sitometresi ile belirlenen mikroglianın iyi veya kötü preparatların örnekler. Normal bir CNS gelen mikroglianın "iyi" izolasyonun söz konusu olduğunda, hücrelerin% 95-98 CD11b% 2-5 ile CD11b + CD45 + düşük microgla temsil eder CD45 hi perivasküler makrofajlar. CD11b az% 1 - CD45 hi lenfositler veya CD11b - CD45 - astroglial veya oligodendroglial hücreler veya hücre parçaları (a) mevcut olmalıdır. CD45 - - hücrelerin yetersiz Percoll gradyanı ayırma düşündüren (b, sol alt kadranda) mevcut "kötü" hazırlık halinde (b) CD11b kontamine% 18 nerede burada gösterilir. Iyi bir preparat halinde, hücrelerin% 95-98 CD11b + CD45 temsil olmalıdırDüşük mikroglia (a, sol üst kadranda), tüm hücrelerin% 2-5 CD11b + CD45 hi perivasküler makrofajlar (a, sağ üst kadranda) temsil etmeli ve tüm hücrelerin% 1 den az CD11b negatif kirletici hücreleri (a, temsil etmeli ) sol alt kadranda. "Kötü hazırlanması" olması durumunda, CD11b önemli kirlenme - CD45 - hücreler veya hücre fragmanları (astroglial, Myelin parçacıkları gibi) RNA'nın izolasyonu ve daha da uygun olmayan hücrelerin hazırlanması kılan, (b, alt sol kadran) mevcuttur analizi. Buna ek olarak, CD11b - CD45 hi hücreleri yetersiz perfüzyon nedeniyle kan lenfositler tarafından kirlenme gösteren (b, alt sağ kadran), aynı zamanda "kötü hazırlanması" halinde mevcut olabilir.
Şekil 2. Flow sitometri analysis ve hastalıklı CNS den mikroglia ve periferik makrofajların nüfus sıralama (a) nöro-inflamasyonu sırasında hücreler üç populasyonunda MSS mevcuttur: CD11b + CD45 düşük (mikroglia), CD11b + CD45 hi (makrofajlar) ve CD11b - CD45. sırasıyla, sol üst, sağ üst ve sağ alt kadranda gösterilen hi (lenfositler). CD11b + CD45 düşük mikroglia ve CD11b nüfus sıralama kapıları + CD45 hi makrofajlar (b) ve tekrar analiz sıralanmış nüfus saflık (c, d) gösterilir gösterilmiştir. FSC / SSC parametrelere göre canlı hücreler üzerinde ön yolluk uygulanmıştır.
Şekil 3. "Iyi" ve "kötü" Qualit örneklerimikroglia izole edilen ve jel elektroforezi ile analiz RNA ler. iyi kalitede bir durumda, RNA merdiven ve RNA (a) açıktır. Kötü kaliteli, yayma ve düşük moleküler ağırlıktaki bozunma ürünlerinin durumda ortaya (b) 'dir.
Şekil 4. Gerçek zamanlı QRT-PCR eğrileri floresan miR-124 ve snoRNA-55 PCR ürünleri etiketli. SnoRNA-55 (a) ve miR-124 (b) için eğriler mikroglia ve kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDMs) için gösterilmiştir. Deney çiftleri yapıldı. (B) 'de gösterildiği gibi, CT değerleri QRT-PCR doğrusal aralığın alt kısmı ile başlangıçtaki kesişimi ile belirlendi kıvrılmaktadır. daha büyük Şekil görüntülemek için .
| snoRNA-55 | miR-124 | DCT = Ct (Exp)-Ct (Norm) | DDCt = DCT-DCT (Referans) | İfade Bağıl Seviye = 2-DDCt | |
| Ct (Norm) | Ct (Exp) | DCT | DDCt | miR-124 İfade | |
| Normal CNS den mikroglia | 24.082 | 24.572 | 0.49 (Referans) | 0 | 1.0 |
| 23.766 | 24.291 | 0.525 | 0.035 | 1.02 | |
| Kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDMs) | 26.879 | 32.231 | 5.352 | 5.317 | 0.025 |
| 26.526 | 32.078 | 5.552 | 5.517 | 0.022 |
MiR-124 (faiz mikroRNA) ve snoRNA-55 (normalleşmesi için kontrol) C t değerleri esas mikroglia vs kemik iliğinden elde edilen makrofajlarda miR-124 ifade göreli seviyeleri Tablo I. hesaplanması.
Şekil 5. Mikroglia ve makrofajlarda miR-124 ekspresyonu analizi. Normal CNS vs kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDMs) den mikroglia yılında miR-124 ekspresyonunun karşılaştırılması (a) gösterilir. Nöro-mikroglia vs ile farelerde bir CNS izole periferal makrofajlarda miR-124 karşılaştırılması (b) 'de gösterilmiştir. DeğişikliklerYetişkin fareleri (8 hafta yaşında azından) ile karşılaştırıldığında, eski 1, 2 ve 4 hafta farelerde gelişimi sırasında mikroglia in miR-124 ifade seviyesini (c) 'de gösterilmiştir. (A, b) deneyi anlama sahip üç kopya halinde yapıldı ± üç ayrı PCR reaksiyon SD gösterilmiştir. Içinde Belirtildiği gibi içinde (c) deneyi çiftleri yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yakın zamanda önemli bir ilgiyi mikroglia ve Nöro ve nörodejenerasyonunun ile ilişkilendirilen birçok patolojilerin bu hücrelerin infiltrasyonu verildi. Ayrıca, bağışıklık ve kanser hücrelerinin farklılaşmasında microRNA rolü önemli ölçüde son birkaç yıl 5,10 içinde büyüdü. Biz önceden normal MSS 7 mikroglia aktive olmayan veya dinlenme fenotip bakım miR-124 rolünü bildirdin, ama mikroglia fenotip ve aktivasyon devlet microRNA diğer türleri rolü keşfedilmeyi beklemektedir. Bu mikroglia özellikle miRNA ifade ölçmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Mikroglia onlar MSS onların izolasyon sonra aktif ve önemli ölçüde değiştirilmiş haline yana deneylerle ele almak zordur hücrelerdir. Normal CNS den mikroglia izolasyonu için protokolleri daha önce 11,12 yayınlandı. Rağmen bu protokolleri CoulRNA izolasyonu için yararlı olacağını, bu protokoller yerine mikroRNA ifade değerlendirilmesi için daha mRNA için daha uygun olduğuna inanıyoruz. Birincisi, pek çok araştırmacı mikroRNA ifadesinde önemli değişiklikler mikroglia ve sonucu aktive homojenize doku veya manyetik boncuk arınma enzimatik sindirimi (gözlem yayınlanmamış) kullanın. İkincisi, yazarlar, özellikle FACS tarafından CNS den dizildi bu popülasyonlar için mikroglial hücreler, az sayıda da mikroRNA analizi için optimal değildir RNA izolasyonu 11 Trizol tabanlı yöntemleri kullanın. Burada, CNS den mikroglia izolasyonu sırasında minimal manipülasyonlar ile hızlı ve basit bir protokol mevcut. Bu yöntem, bir hücre az sayıda RNA'nın izolasyonu için etkili bir teknik ile kombine spontan aktivasyonunun minimal düzeyde sahip mikroglianın saf popülasyonlarının alıcı sağlar. Buna ek olarak, özellikle de zenginleştirilmiş edilecektir RNA'nın izolasyonu için kullanılan protokolKısa kodlamayan RNA ve mikroRNA ile.
İzole mikroglianın saflığı yanı sıra, RNA kalitesi uygun olduğundan emin olmak için de önemlidir. Percoll yokuş mikroglia uygun ayrımı olmadan sonuç mikroglia miRNA profilleme yapacak zor yorumlamak için değil sadece, aynı zamanda bir yüksek konsantrasyon nedeniyle çok büyük ölçüde RNA kalitesini düşürür miyelin artıkları olan RNA örneklerinin kirlenme olduğunu nükleik asitler, protein ve miyelin parçacıklar lipidler.
Mikroglia miRNA ifadesi ölçülerek in yukarıda belirtildiği gibi, kayda değer bir zorluk farelerin büyük bir grup (10 ya da daha fazla) bile elde edilen RNA hücreleri ve düşük miktarda küçük bir sayıdır. Daha az duyarlı multipleks PCR veya diziler kullanarak daha Dolayısıyla 10-30 microRNA kısa bir listesini yapmak tavsiye ederim ve singleplex QRT-PCR yerine birini kullanarak her bir ifade düzeyinde ayrı ayrı bakmakRNA oldukça yüksek miktarda gerektirir. Bu tarif edildiği gibi singleplex QRT-PCR ile birkaç microRNA ile ifade değerlendirilmesinden sonra, diğer büyük ölçekli miRNA profil yöntemleri bunların dikkatli bir doğrulama sonra kullanılabilir. Son zamanlarda, potansiyel mikroglia büyük ölçekli mikroRNA ekspresyon profili için kabul edilebilir Mikroakiskan platformlarda 13 üzerinde microRNA ve multipleks analizi için daha duyarlı bir yöntem hakkında bir rapor vardı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Çalışma NIH R01 NS071039-01A1 araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b-PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L.
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P.
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
