Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l'activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.
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Article de méthode
Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation
Dans cet article
Résumé
Résumé
Microglie sont des cellules de la lignée myéloïde qui résident dans le système nerveux central (SNC) 1. Ces cellules jouent un rôle important dans les pathologies de nombreuses maladies associées à la neuroinflammation tels que la sclérose en plaques (MS) 2. La microglie dans quelques SNC normal exprimer macrophages marqueur CD11b et présentent un phénotype de repos en exprimant de faibles niveaux de marqueurs d'activation tels que CD45. Lors d'événements pathologiques dans le système nerveux central, la microglie sont activés tel que déterminé par la régulation positive de CD45 et d'autres marqueurs 3. Les facteurs qui influent sur le phénotype des microglies et les fonctions dans le SNC ne sont pas bien étudiés. Les microARN (miARN) sont une famille de plus en plus de molécules conservées (~ 22 nucléotides de long) qui sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques normaux tels que la croissance et la différenciation cellulaire 4 et pathologies telles que l'inflammation 5. MiARN régulent à la baisse l'expression de certains gènes cibles en se liant des séquences complémentaires de laARNm ir et de jouer un rôle important dans l'activation des cellules immunitaires innées dont les macrophages et la microglie 6 7. Afin d'étudier les voies médiées par miRNA qui définissent le phénotype des microglies, la fonction biologique, et de distinguer les microglies d'autres types de macrophages, il est important d'évaluer quantitativement l'expression de microARN spécifiques dans des sous-ensembles distincts de SNC-résident microglie. Les méthodes courantes pour mesurer l'expression des miARN dans le SNC comprennent la PCR quantitative à partir de tissu neuronal et de toute hybridation in situ. Cependant, la PCR quantitative à partir de broyat de tissu ensemble ne permet pas l'évaluation de l'expression de miARN dans la microglie, qui ne représentent que 5-15% des cellules de tissu neuronal. Hybridation in situ permet l'évaluation de l'expression de microARN dans des types cellulaires spécifiques dans les coupes de tissus, mais cette méthode n'est pas entièrement quantitative. Dans ce rapport, nous décrivons une amélioration quantitative et sensitive méthode pour la détection de miARN par PCR en temps réel dans la microglie isolés de SNC normal ou pendant l'utilisation neuroinflammation encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), un modèle de souris pour MS. La méthode décrite sera utile pour mesurer le niveau d'expression des microARN dans la microglie dans le SNC normal ou en neuroinflammation associée à diverses pathologies, y compris MS, accident vasculaire cérébral, un traumatisme, la maladie d'Alzheimer et les tumeurs cérébrales.
Protocole
1. Isolement des cellules microgliales du SNC normal
Isolement de la microglie est effectué comme cela a été décrit précédemment, avec les adaptations 3.
- Préparer les instruments de dissection et de la perfusion: ciseaux, pinces, une seringue de 10 ml avec aiguille 27g, 15 ml Dounce homogénéisateur (téflon / verre), 40 tamis cellulaire um nylon, 40% et 70% des solutions de Percoll, PBS 1X.
- Euthanasier les souris par asphyxie rapide (privation d'oxygène) dans le CO 2 la caméra et de les transférer immédiatement sur le banc de laboratoire pour les manipulations chirurgicales et de perfusion. ....
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Discussion
Récemment un intérêt significatif a été donné à la microglie et l'implication de ces cellules dans de nombreuses pathologies associées à la neuroinflammation et la neurodégénérescence. En outre, le rôle des microARN dans la différenciation des cellules immunitaires et le cancer a considérablement augmenté au cours des dernières années, plusieurs 5,10. Nous avons déjà signalé le rôle de miR-124 dans le maintien du phénotype non activé ou au repos de la microglie dans le SNC normales 7, mais le r.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Le travail a été soutenu par le NIH R01 NS071039-01A1 subvention de recherche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| PBS 1X | GIBCO | 14190 | Peuvent être préparés à partir de composants secs dans le laboratoire, pH: 7.2 à 7.4 |
| PBS 10X | Thermo Scientific | SH30258.02 | Peuvent être préparés à partir de composants secs dans le laboratoire, pH: 7.2 à 7.4 |
| DMEM; FBS | BCBG | 11965; 10438 | |
| Mirvana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml de Percoll 100% est préparée en mélangeant 10 ml de PBS 10X et 90 ml de Percoll de Sigma. 50 ml de Percoll 70%préparé par le mélange de 35 ml de Percoll à 100% et 15 ml de DMEM 50 ml de Percoll 40% est préparée par mélange de 20 ml de Percoll 100% et 30 ml de 1X PBS |
| MOG 35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Toxine de la coqueluche | Sigma | P7208 | |
| FcR anticorps bloquants | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b - PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Peut être utilisé avec différents fluorophores (par exemple AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Peut être utilisé avec différents fluorophores (par exemple APC) |
| Paraformalhyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Diluer 1:15 dans du PBS 1X |
| 15% TBE-urée Gel | Life Technologies Inc | EC68855BOX | |
| MicroRNA TaqMan Kit de transcription inverse | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| Les dosages TaqMan microARN miR-mmu-124a | Life Technologies Inc | 4427975 001182 ID | |
| Les dosages TaqMan microARN snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 001228 ID | |
| Eau sans nucléase | Life Technologies Inc | AM9937 | Eau sans nucléase |
| Plaque 384 puits clair réaction optique | Life Technologies Inc | 4309849 | Peut être remplacé par d'autres plaques (par exemple une plaque de 96 puits) dans les différents instruments de PCR en temps réel |
| Dounce homogénéisateur (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon / verre |
| 40 tamis cellulaire μ en nylon | Faucon | 352340 | |
| Centrifugeuse Big | Sorval | RT 6000B | Diamètre du rotor 18,5 cm |
| Petite centrifugeuse | Eppendorf | 5415 R | Rotor diamètre de 6,5 cm |
| En temps réel instrument PCR | Life Technologies Inc | AB 7900 HT | Peut être remplacé par d'autres instruments |
| Cytomètre en flux | BD Biosciencess | LSR II | Peut être remplacé par d'autres instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Peut être remplacé par d'autres instruments |
| Spectrophotomètre Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Références
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
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