Mätning av livslängden i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster är en kraftfull modell organism för att utforska den molekylära grunden för livslängd reglering. Detta protokoll kommer att diskutera de olika stegen i generering av en reproducerbar, populationsbaserade mätning av livslängden samt potentiella fallgropar och hur man undviker dem.
Abstract
Åldrande är ett fenomen som resulterar i jämn fysiologisk försämring nästan alla organismer som har undersökts, vilket leder till minskad fysisk prestationsförmåga och ökad risk för sjukdom. Individuell åldrande är uppenbar på populationsnivå som en ökning av åldersberoende dödlighet, som ofta mäts i laboratoriet genom att observera livslängd i stora kohorter av åldersmatchade individer. Experiment som syftar till att kvantifiera i vilken utsträckning genetisk eller miljömässig manipulationer påverkar livslängden i enkla modellorganismer har varit anmärkningsvärt framgångsrika för att förstå de aspekter av åldrandet som är konserverade mellan taxa och inspirerande nya strategier för att utöka livslängden och förhindra ålder-associerad sjukdom hos däggdjur .
Ättika flyga, Drosophila melanogaster, är en attraktiv modell organism för att studera mekanismerna för åldrande på grund av dess relativt korta livslängd, bekväm djurhållning, och enkel genetik.Men demografiska mått på åldrande, inklusive åldersspecifik överlevnad och dödlighet, är utomordentligt känsliga för även små variationer i experimentell design och miljö, och upprätthållandet av strikta laboratoriepraxis så länge åldrande experiment krävs. Dessa överväganden tillsammans med behovet att öva noggrann kontroll av genetisk bakgrund, är avgörande för att generera robusta mätningar. Det finns faktiskt många anmärkningsvärda kontroverser kring slutledning från livslängd experiment i jäst, maskar, flugor och möss som har spårats till miljö-eller genetiska artefakter 1-4. I detta protokoll beskriver vi en rad förfaranden som har optimerats under många år för att mäta livslängd i Drosophila med laboratorium flaskor. Vi beskriver också användningen av dLife programvara som har utvecklats av vårt laboratorium och finns för nedladdning ( http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / mjukvara). dLife accelererar genomströmningen och främjar god praxis genom att införliva optimal experimentell design, vilket förenklar flyga hantering och insamling av data, och standardisera dataanalys. Vi kommer också att diskutera de många potentiella fallgropar i utformningen, insamling och tolkning av livslängd data och vi tillhandahåller åtgärder för att undvika dessa faror.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver ett förfarande för framställning av reproducerbara mätningar av vuxen livslängd i Drosophila som är anpassningsbart för bedömning av genetiska, farmakologiska och miljömässiga åtgärder. Avgörande aspekterna av protokollet inkluderar noggrant kontrollera larver utvecklingsmiljö, minimera vuxna stress och minimera partiskhet över experimentella grupper och kontroller. Vi presenterar också användningen av dLife livslängd experimentet programvara. Genom a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från Ellison Medical Foundation (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp ), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/ ), NIH 5T32GM007315-35 (JR) och NIH R01AG030593 (SDP). Detta arbete utnyttjade resurserna i Drosophila Aging Core (DAC) i Nathan Shock Center of Excellence i biologi av åldrandet finansieras av National Institute of Aging P30-AG-013.283 ( http://www.nih.gov/ ). Författarna vill tacka Pletcher Laboratoriet för hjälp diskussioner och särskilt Brian Chung för kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka för Nick Asher och Kathryn Borowicz för hjälp med datainsamling.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
