מדידה של תוחלת חיים ב<em> דרוזופילה melanogaster</em
Summary
דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל רב עצמה לחקר הבסיס המולקולרי של ויסות אריכות ימים. פרוטוקול זה יעסוק השלבים הכרוכים ביצירת מדידה לשחזור, המבוסס על אוכלוסייה של אריכות ימים, כמו גם בעיות פוטנציאליות וכיצד להימנע מהם.
Abstract
הזדקנות היא תופעה שגורם להידרדרות פיזיולוגית מתמדת בכל כמעט אורגניזמים שבו זה כבר נבדק, מוביל לביצועים פיסיים מופחתים ועלייה בסיכון למחלה. הזדקנות אדם היא מניפסט ברמת האוכלוסייה כעלייה בתמותה תלויה גיל, אשר לעתים קרובות שנמדדה במעבדה על ידי התבוננות תוחלת חיים בקבוצות גדולות של אנשי גיל מתאים. ניסויים המבקשים לכמת את המידה שבה גנטית או סביבתית מניפולציות השפעת תוחלת החיים באורגניזמים מודל פשוטים הייתה מוצלחת להפליא להבנת ההיבטים של הזדקנות, הנשמרים על פני מינים ועל אסטרטגיות חדשות להארכת תוחלת חיים מעוררי השראה ומניעת גיל הקשורים למחלה ביונקים .
זבוב החומץ, דרוזופילה melanogaster, הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר מנגנוני הזדקנות, בשל אורך חיים הקצרים יחסית, גידול נוח, ושטחית גנטיקה.עם זאת, צעדים דמוגרפיים של הזדקנות, כולל הישרדות גיל ספציפי ותמותה, הם רגישים במיוחד אפילו שינויים קלים בעיצוב וסביבה ניסיוניים, והתחזוקה של נהלים מחמירים למעבדת משך ניסויי הזדקנות נדרשה. שיקולים אלה, יחד עם הצורך לתרגל שליטה קפדנית של רקע גנטי, הם חיוניים ליצירת מדידות חזקות. ואכן, יש הרבה מחלוקות בולטות המקיפות היקש מניסויי מאריך חיים בשמרים, תולעים, זבובים ועכברים שהיו לייחס לחפצים סביבתיים או גנטיים 1-4. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת הנהלים שהיו מותאמים לאורך שנים רבות של מדידת אריכות ימים בדרוזופילה באמצעות בקבוקוני מעבדה. גם אנו מתארים את השימוש בתוכנת dLife, אשר פותח על ידי המעבדה שלנו, והוא זמין להורדה (http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab / תוכנה). dLife מאיץ את התפוקה ומקדמת שיטות עבודה טובות בעיצוב ניסיוני אופטימלי שילוב, פישוט טיפול זבוב ואיסוף נתונים, ניתוח נתונים ותקנון. נדונונו גם את החסרונות הפוטנציאליים רבים בתכנון, איסוף, ופרשנות של נתוני תוחלת חיים, ואנו מספקים צעדים כדי למנוע סכנות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה להפקת מדידות לשעתק לאריכות ימים בוגרות בדרוזופילה שניתן ליישם לצורך ההערכה של התערבויות גנטיות, תרופתיות וסביבתיות. היבטים חשובים של הפרוטוקול כוללים שליטה בזהירות את סביבת פיתוח הזחל, צמצום מתח למבוגרים, ומזעור הטיה על פני קבוצו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אליסון הרפואי (SDP, http://www.ellisonfoundation.org/index.jsp), NIH K01AG031917 (NJL, http://www.nih.gov/), NIH 5T32GM007315-35 (JR) וNIH R01AG030593 (SDP). עבודה זו מנוצלת משאבים של דרוזופילה הזדקנות Core (DAC) של מרכז ההלם נתן למצוינות בביולוגיה של ההזדקנות מומן על ידי המכון הלאומי להזדקנות P30-AG-013283 (http://www.nih.gov/). המחברים מבקשים להודות למעבדת Pletcher לדיונים מועילים ובעיקר בריאן Chung לקריאה ביקורתית של כתב היד. ברצוננו להודות ניק אשר וקתרין Borowicz לסיוע באיסוף נתונים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Active Dry Yeast | Fleishmann’s Yeast | 2192 | |
| Grape Agar Powder Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Large Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Large Replacement End Caps | Genesee Scientific | 59-103 | |
| 6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Flugs Closures for Stock Bottles | Genesee Scientific | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide, Polystrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Flugs Closures for Wide Vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Wide Orifice Aardvark Pipet Tips, 200 ul | Denville Scientific | P1105-CP | |
| Flystuff Flypad, Standard Size | Genesee Scientific | 59-114 | |
| BD Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 O.D. x 15 mm H; | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Kimax* Colorware Flasks 1,000 ml yellow | Fisher Scientific | 10-200-47 | |
| PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 | |
| Gelidium Agar | Mooragar | n/a | |
| Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 0290331280 | |
| Granulated Sugar | Kroger | n/a | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-266 | Fly Food Preservative |
| Propionic Acid, 99% | Acros Organics | 149300025 | Fly Food Preservative |
| Kanamycin Sulfate | ISC BioExpress | 0408-10G | |
| Tetracycline HCl | VWR | 80058-724 |
References
- Toivonen, J. M., et al. No influence of Indy on lifespan in Drosophila after correction for genetic and cytoplasmic background effects. PLoS Genet. 3, e95 (2007).
- Spencer, C. C., Howell, C. E., Wright, A. R., Promislow, D. E. Testing an ‘aging gene’ in long-lived drosophila strains: increased longevity depends on sex and genetic background. Aging Cell. 2, 123-130 (2003).
- Burnett, C., et al. Absence of effects of Sir2 overexpression on lifespan in C. elegans and Drosophila. Nature. 477, 482-485 (2011).
- Bokov, A. F., et al. Does reduced IGF-1R signaling in Igf1r+/- mice alter aging?. PLoS One. 6, e26891 (2011).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Information Service. 34, 117-118 (1960).
- Skorupa, D. A., Dervisefendic, A., Zwiener, J., Pletcher, S. D. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 7, 478-490 (2008).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metab. 14, 623-634 (2011).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 53, 457-481 (1958).
- Pletcher, S. D. Mitigating the Tithonus Error: Genetic Analysis of Mortality Phenotypes. Sci. Aging Knowl. Environ. 2002, pe14 (2002).
- Pletcher, S. D., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Why do life spans differ? Partitioning mean longevity differences in terms of age-specific mortality parameters. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55, 381-389 (2000).
- Promislow, , Tatar, , Pletcher, , Carey, Below-threshold mortality: implications for studies in evolution, ecology and demography. Journal of Evolutionary Biology. 12, 314-328 (1999).
- Pletcher, Model fitting and hypothesis testing for age-specific mortality data. Journal of Evolutionary Biology. 12, 430-439 (1999).
- Partridge, L., Gems, D. Benchmarks for ageing studies. Nature. 450, 165-167 (2007).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 12602-12607 (2001).
- Ford, D., et al. Alteration of Drosophila life span using conditional, tissue-specific expression of transgenes triggered by doxycyline or RU486/Mifepristone. Exp. Gerontol. 42, 483-497 (2007).
- Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, 927-935 (2002).
- Smith, E. M., et al. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J. Nutr. 137, 2006-2012 (2007).
- Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. J. Insect Physiol. 47, 1301-1307 (2001).
- Bass, T. M., et al. Optimization of dietary restriction protocols in Drosophila. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1071-1081 (2007).
- Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1976).
- Pittendrigh, C. S., Minis, D. H. Circadian systems: longevity as a function of circadian resonance in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1537-1539 (1972).
- Joshi, A., Mueller, L. D. Adult crowding effects on longevity in Drosophila melanogaster: Increase in age-dependent mortality. Current Science. 72, 255-260 (1997).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 8253-8256 (2007).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 2498-2503 (2008).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
