Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار
Summary
نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.
Abstract
الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع 1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal 2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا 4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة 4.
هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع.
أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة 2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء المقدمة هنا يوفر وسيلة لتفقد البنية الداخلية للمجتمعات الخميرة. الخطوة تحديد الميثانول يجعل مستعمرة الخميرة جامدة 8 و يحافظ على سلامة المستعمرة، ومع ذلك، فإنه يتسبب أيضا 8 الانكماش التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج. نرى عادة حوالي 3…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جوناثان كوبر مختبر في مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان للحصول على إذن لاستخدام ناظم البرد بهم. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة كيك WM. BM هو زميل غوردون مور وبيتي من علوم الحياة مؤسسة البحوث. ونحن ممتنون لGottschling دانيال لبروتوكول قسمة له تثبيت معنا.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Génétique. 184 (3), 707-716 (2010).
