蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ
Summary
我々は、蛍光細胞の内部のパターンを観察するために酵母コミュニティを凍結および凍結セクショニングするためのプロトコルを提示します。この方法は、メタノール固定に依存しており、コミュニティ内での蛍光タンパク質を不活性化することなく、細胞の空間的な分布を維持するために10月エンベディング。
Abstract
微生物は、一般的に地域社会に住んでいます。コミュニティ内での細胞の空間的な組織は、コミュニティ1の生存と機能に影響を及ぼすと考えられている。焦点と二光子顕微鏡を含む光学セクショニング技術は、細菌や古細菌群集2,3の空間組織を観察するために有用であることが証明されています。酵母のコロニーの共焦点イメージングおよび物理的なセクショニングの組み合わせは、セル4の内部組織を明らかにした。しかし、共焦点や2光子顕微鏡を用いた直接的な光学セクショニングは、酵母のコロニーの奥深くまで少数の細胞層に到達することができるだけであった。この制限があるため4酵母細胞からの光の強い散乱の可能性があります。
ここでは、固定及びSaccharomyces cerevisiaeのコミュニティ内で蛍光細胞の空間分布を得るために、凍結セクショニングに基づく方法を提案する。我々は、定着剤としてメタノールを使用細胞の空間分布を保存する方法について説明します。固定されたコミュニティはクライオスタットにおけるOCT化合物、冷凍、および凍結切片を浸透されています。セクションの蛍光イメージングは、コミュニティ内の蛍光細胞の内部組織を明らかにする。
赤と緑の蛍光タンパク質を発現する株から成る酵母コミュニティの例としては、同様に酵母のコロニー2,3内の遺伝子発現の場合と蛍光細胞の空間分布を明らかにするために凍結セクショニング法の可能性を実証している。我々の焦点は、Saccharomyces cerevisiaeのコミュニティになっているにもかかわらず、同じ方法を用いて、潜在的に他の微生物群集を検討するために適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する手順は、酵母のコミュニティの内部構造を検査する方法を提供します。メタノール固定工程は8リジッド酵母コロニーを作り、コロニーの整合性を維持しますが、それはまた、結果を解釈する際に考慮すべき8収縮を引き起こす。我々は通常、直接9を固定せずに 10月中に埋め込 まれたコロニーに比べて酵母のコロニーの高さの約30％…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らのクライオスタットを使用するための許可フレッドハッチンソンがん研究センターのジョナサン·クーパーラボに感謝したいと思います。この作品は、NIHとWMケック財団によってサポートされていました。 BMは、ライフサイエンス研究財団のゴードンとベティ·ムーア仲間です。私達は私達と彼の固定プロトコルを共有するためのダニエルGottschlingに感謝しています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
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