Cryosectioning дрожжи Сообщества для экспертизы флуоресценции Patterns
Summary
Мы представляем протокол для замораживания и cryosectioning дрожжей общин соблюдать внутренние модели флуоресцентные клетки. Метод основан на фиксации метанолом и октябре-вложение сохранить пространственное распределение клеток без инактивации флуоресцентных белков внутри сообщества.
Abstract
Микробы, как правило, живут в общинах. Пространственной организации клеток внутри сообщества, как полагают, влияют на выживание и функционирование сообщества 1. Оптические методы секционирования, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, доказали свою полезность для наблюдения пространственной организации бактерий и архей общинами 2,3. Сочетание конфокальной микроскопии и физического срезов дрожжевых колоний показало, внутренней организации клеток 4. Тем не менее, прямых оптических срезов с помощью конфокальной или двух-фотонного микроскопа были только способны достигать нескольких слоев клеток дрожжей в глубь колонии. Это ограничение, скорее всего, из-за сильного рассеяния света из дрожжевых клеток 4.
Здесь мы представляем метод, основанный на установлении и cryosectioning получить пространственное распределение флуоресцентных клеток внутри общины Saccharomyces CEREVISIAE. Мы используем метанол в качестве закрепителясохранить пространственное распределение клеток. Исправлена общины проникли с октября соединение, замороженные и cryosectioned в криостат. Флуоресценции из разделов раскрывает внутреннюю организацию флуоресцентные клетки внутри сообщества.
Примеры дрожжей общины, состоящей из штаммов выразив красного и зеленого флуоресцентного белка продемонстрировать потенциал cryosectioning метод выявления пространственного распределения флуоресцентные клетки, а также, что экспрессии генов в дрожжевых колоний 2,3. Хотя наш акцент был сделан на общины Saccharomyces CEREVISIAE тот же метод потенциально может быть применен для изучения других микробных сообществ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедура представленные здесь предлагается способ проверить внутреннюю структуру дрожжей общин. Шаг метанола крепления делает дрожжей колонии жесткого 8 и сохраняет целостность колонии, однако, это также приводит к усадке 8, которые должны быть приняты во внимание при ин?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Jonathan Cooper лаборатории на Фреда Хатчинсона онкологический научный центр на разрешение использовать их криостата. Эта работа была поддержана NIH и WM Keck Foundation. BM является членом Гордона и Бетти Мур жизни Фонда исследований науки. Мы благодарны Daniel Gottschling для обмена его крепления протокол с нами.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Génétique. 184 (3), 707-716 (2010).
