Summary
Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.
Abstract
Testículos mamíferos são órgãos muito complexos que contêm mais de 30 diferentes tipos de células, incluindo as células testiculares somáticas e diferentes estágios de células germinativas. Esta heterogeneidade é uma desvantagem importante em relação ao estudo das bases da espermatogénese mamíferos, visto que são necessárias populações puras ou enriquecidas de células em determinadas fases do desenvolvimento do esperma para a maioria das análises moleculares 1.
Várias estratégias, tais como Staput 2,3, uma elutriação centrífuga, e por citometria de fluxo (FC) de 4,5 foram utilizados para a obtenção de populações de células testiculares enriquecida ou purificada, a fim de permitir que os estudos de expressão diferencial de genes.
Exige-se que as células estão em suspensão para a maioria das abordagens de enriquecimento / purificao. Idealmente, a suspensão de células seja representativo do tecido original, possuem uma elevada proporção de células viáveis e alguns multinucleates - que tendem a formar por causa donatureza sincicial do epitélio seminífero 6,7 - e aglomerados de células falta um. Relatórios anteriores evidenciaram que as suspensões de células testiculares preparados por um método exclusivamente mecânica agregada mais facilmente do que os tripsinizados 1. Por outro lado, os tratamentos enzimáticos com ARNases e / ou desagregação das enzimas como a tripsina e a colagenase, levar à deterioração macromoléculas específicas, o que é indesejável em certas aplicações a jusante. O processo ideal deveria ser tão curto quanto possível e envolvem manipulação mínima de modo a conseguir uma boa conservação das macromoléculas de interesse, tal como ARNm. Protocolos actuais para a preparação de suspensões de células a partir de tecidos sólidos são geralmente demorados, altamente dependente do operador, e podem danificar selectivamente certos tipos de células 1,8.
O protocolo aqui apresentado combina as vantagens de uma desagregação mecânica altamente reprodutível e extremamente breve com o umbsence de tratamento enzimático, que conduz a boas suspensões de células de qualidade que possam ser utilizados para a análise por citometria de fluxo e a triagem 4, e os estudos de expressão de genes posteriores 9.
Protocol
1. Preparação de suspensões de células
- Sacrificar o espécime a ser utilizado seguindo as recomendações das comissões especializadas, como IACUC ou equivalente (no Uruguai, Comissão Nacional de Experimentação Animal [CNEA]). No nosso caso, uma dose excessiva de pentobarbital foi administrada.
- Dissecar testículos seguindo procedimentos padrão aprovados e colocá-los num copo 96 milímetros de Petri em gelo, contendo 10 ml de DMEM gelada suplementada com soro de vitela fetal a 10%.
- Remover a túnica albugínea dos testículos e cortado em pedaços descapsulados quadrados de 2 - 3 mm de cada lado.
- Essas peças são depois processados num Medimachine, um moinho mecânico automatizado, onde o tecido é desagregado no interior de uma unidade descartável que contém uma tela de aço inoxidável perfurada e um rotor de metal. Para isso, coloque 1 ml de DMEM suplementado frio e 4-5 dessas peças em uma unidade de 50 mm descartável, ligue o disaggregator, e processo durante 50 seg, seguindo as instruções do fabricante simples.
- Recuperar a suspensão de células resultante a partir da unidade de desagregação usando um grupo 3 - 5 ml de seringa sem agulha.
- Filtrar com um mM malha 50 nylon, previamente embebidas com 0,5 ml de DMEM suplementado.
- Filtrar a suspensão novamente usando um encharcada 25 mM malha de nylon, e colocar no gelo.
- Contagem numa câmara de Neubauer e ajuste a concentração celular a 1-2 x 10 7 células / ml com DMEM suplementado. Pelo menos 4 x 10 7 células / grama de material de testículos são usualmente obtidas.
- Finalmente, adicionar NDA (2-naftol-6 ,8-dissulfónico, sal de dipotássio) para uma concentração final de 0,2%, a fim de evitar a aglutinação de células.
- Opcional: verificar a viabilidade celular das suspensões de células testiculares com um kit disponível comercialmente para a viabilidade de células animais, seguindo as instruções do fabricante.
2. Análise citométrica
ve_content "> Usámos um Becton-Dickinson FACSVantage citómetro de fluxo equipado com um laser de iões de árgon Coherent sintonizado para emitir a 488 nm para análise das células coradas com altas concentrações de iodeto de propídio (PI). (A questão da entrada em PI não fixado células sob estresse tem sido abordada em outros lugares 9,10).- Para a coloração de PI, adicionar fluorocromo a uma concentração final de 50 ug / mL à suspensão de células, e incubar durante 10 min a 0 ° C no escuro.
- Potência do laser é ajustado para 100 mW e um filtro passa 575/26 banda é usado para coletar PI-fluorescência emitida em FL2.
- Realizamos medições FC com um bico de 70 mM. Para classificar as populações espermatócitos, defina o modo de classificação em Normal-R ou Normal-C, usando 3 gotas classificadas como envelope. Mantenha a amostra e os tubos de recolha de 3-4 ° C, utilizando uma unidade de refrigeração. Ajustar amostra diferencial para analisar as células a uma taxa de 500 a 1500 por segundo.
- Use software CellQuest (BD) para analisaros seguintes parâmetros: Forward Scatter (FSC-H); dispersão lateral (SSC-H); fluorescência emitida ou total da área de pulso (FL2-A); ea duração da emissão de fluorescência ou por largura de pulso (FL2-W).
Alternativamente, podemos ter empregado o corante vital Hoechst 33342 para uma concentração final de 5 ug / ml e incubada durante 10 min a 37 ° C no escuro. A análise celular foi realizada por meio de um citómetro MoFlo (DakoCytomation), equipado com um laser de UV de comprimento de onda de excitação regulado para 25 mW e com um bocal de 70 um. Manipulação de dados foi realizada com o software Summit v4.3 (DakoCytomation).
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Representative Results
Um exemplo de uma suspensão de células bem desagregada preparados a partir de testículos de ratos com o protocolo aqui descrito é mostrado na Figura 1.
Em comparação com os tratamentos enzimáticos 6,8 a desagregação e a métodos mecânicos descritos anteriormente 2, o que foi apresentado aqui é muito mais rápido, envolve menos manuseamento, é facilmente reprodutível (não dependente do operador), os detritos celulares e torna escassa (especialmente em comparação com a outra mecânica Métodos) e muito poucos multinucleates (que já foram descritas de forma a formar uma consequência da manipulação de tecido extensa 1,2). Além disso, ao contrário de tratamentos enzimáticos, evita-se o uso de ARNases, tripsina e colagenase, que podem favorecer macromoléculas degradação.
Por outro lado, apesar de relatos anteriores haviam demonstrado que as suspensões de células testiculares preparados por um método mecânico exclusivamente aglutinado mais facilmente do que em tripsinizadases 1, a aplicação do presente método torna-se muito pouca aglomeração nas suspensões celulares, como pode ser visto na Figura 1. Nesse sentido, encontramos a inclusão de NDA muito eficiente na prevenção de agregação de células, e evitar o entupimento dos bocais durante estudos de fluxo posteriores. Figura 1 também revela a escassez de detritos de células, que é também evidente nas FC histogramas representados na Figura 2.
Além disso, as suspensões de células preparadas com este método mostra uma representação adequada dos diversos tipos de células dos testículos. Esta conclusão foi, comparando a composição celular de suspensões de células testiculares preparados pelo método aqui apresentado com os dados relatados a partir da contagem de células nas secções transversais dos túbulos seminíferos e com suspensões de células preparadas usando outros métodos bem (Tabela 1).
FC histogramas obtidos para suspensões preparadas pela preseprotocolo nt e coradas quer com Hoechst 33342 (Figura 2A) ou PI (Figura 2B) não difere substancialmente dos 8 aos previamente relatados, apoiando também a hipótese de que o procedimento não danificar selectivamente qualquer tipo de célula específico.
| Tipos de células testiculares com base no conteúdo de DNA | Testículo intacta a (%) | Suspensões preparadas b (%) - Medimachine | Suspensões tripsinizados um (%) |
| A) Mus musculus | |||
| C | 66,2 | 62.5 | 79,6 |
| 2C | 16,4 | 18,4 | 7.3 |
| 4C </ Td> | 17,9 | 18,7 | 8,7 |
| Outros | - | - | 4.6 |
| B) Cavia porcellus | |||
| C | 66.5 | 65.5 | N / D |
| 2C | 11,0 | 11,5 | N / D |
| 4C | 22.5 | 23,0 | N / D |
| uma contagem celular foram avaliadas por observação microscópica. As contagens de células B foram avaliadas por citometria de fluxo. | |||
Tabela 1. Percentagens relativas de populações de células testiculares adultos diferem em seu conteúdo de DNA para suspensões de células de rato (A) e cobaia (B) preparados pelo método apresentado, em comparação com testículos intactos e - para rato - tØ suspensões de tripsina-preparadas (modificado de Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Resolução genoma. 128, 46 (2010)). Conteúdo de DNA são: C (espermátides arredondadas e alongamento, espermatozóides), 2C (células somáticas testiculares, espermatogônias, espermatócitos secundários) e 4C (espermatócitos primários e espermatogônias proliferando poucos em fase G2).
Figura 1. Vista parcial de uma suspensão de células a partir de testículos de ratos adultos preparados pelo presente protocolo e visualizadas por microscopia de contraste de fase. Como pode ser visto, citoplasma celular estão bem conservadas. A barra corresponde a 25 um. Reproduzido de Rodríguez-Casuriaga, et al., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).
Figura 2. FC análise do conteúdo de ADN de suspensões de células testiculares de ratos adultos, ratos, cobaias, e a partir de 21 dias após o parto (DPP), filhotes de rato, corados com o corante vital Hoechst 33342 (A) ou com a PI (B). Em todos os casos populações de células C, 2C e 4C podem ser facilmente revelados nos histogramas obtidos com ambos os corantes, assim como o pico aparentemente sub-haplóide à esquerda da população C. Este último pico foi demonstrada para conter os espermatozóides, os quais aparecem como uma subpopulação menos coradas separada devido ao seu estado de cromatina condensada 12. Note-se a escassez de detritos em todos os gráficos. Isto é especialmente evidente no 21 DPP (espécimes juvenis) perfis, que carecem de espermátides e espermatozóides. Modificado de Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res genoma. 128, 46 (2010). Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 3. População de células 4C classificados partir de uma suspensão de células de testículo de rato adulto. Células seleccionadas foram depositadas sobre lâminas limpas com poli-L-lisina-tratados e observados sob microscopia de contraste de fase (A) ou de campo claro após coloração Giemsa (B). Barra = 20 uM. Reproduzido de Geisinger e Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Res genoma. 128, 46 (2010).
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. Figura 4 A) de uma análise FC cobaia suspensão de células de testículo adulto preparado com o protocolo descrito aqui (um), de histograma,. (B), ponto trama. Observe as duas subpopulações de células na população em 4C. B) Análise de células seleccionadas a partir de R3 4C (a, b) e R4 (a ', b') regiões. (A, A '), as imagens de microscópio de epifluorescência de células PI-coradas . Note-se que os núcleos de região R3 são comparativamente menores. Barras: 10 mM (b, b '), microscopia laser confocal de reacções imunocitoquímicos propagação em células usando um anticorpo contra Sycp3 (complexo Sinaptonêmico [SC] proteína 3, um componente de elemento lateral).. O quadro permite concluir que a fração R3 corresponde ao início meiócitos (lepto / zigóteno), em que os eixos simples e trechos curtos de SCs podem ser vistos, enquanto R4 contém meiócitos paquíteno, com comcompletamente montado SCs. Modificado de Rodríguez-Casuriaga, et al., Citometria A. 79, 625 (2011). Clique aqui para ver a figura maior.
Figura 5. A) electroforese em gel de agarose dos RNAs totais extraídos espermatogénica flow-classificados fracções de células 2C, R3 e R4 (explicação sobre as duas últimas fracções é na Figura 4). Suspensões celulares foram preparados com o protocolo aqui descrito. B) Autoradiograma de uma desnaturação electroforese em gel de poliacrilamida que mostra bandas de cDNA diferenciais obtidos por meio do método de "ARNm de exibição diferencial" (RNAimage; GenHunter Corporation, Nashville, TN) para uma das combinações de iniciadores a partir do kit. mRNAs a partir dos mesmos três populações de células, como no
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Discussion
O método descrito aqui optimizado permite a preparação de suspensões de células a partir de tecido testicular de roedores de um modo muito rápido e reprodutível, evitando o tratamento enzima e detergente e de manter uma boa integridade da célula e tipo proporções. A brevidade do procedimento (a 15 min extensão inclui dissecção testículo, corte de tecido, e transformação), envolva um mínimo de manipulação, e na ausência de tratamentos enzimáticos são algumas das principais vantagens. Todas estas representarão a boa conservação das macromoléculas de vida curto, o que é crítico quando uma amostra representativa dos compostos presentes na população de células original é requerida.
Quanto à utilização de um ou outro PI ou Hoechst 33342, nós não observaram diferenças evidentes nos perfis resultantes da análise de citometria de fluxo de suspensões de células testiculares, com o emprego de um ou outro corante. A escolha da tintura vai sim depender de preferências e disponibilidades do usuário, ena posterior utilização planejada. Por um lado, o PI é mais barato, e de aplicação generalizada como não requer a utilização de citómetros de fluxo e triagem com um laser de UV. Por outro lado, apesar de se ter utilizado com sucesso células PI-coradas para triagem ulterior e estudos de expressão diferencial de genes (Figura 4), a Hoechst 33342 ou outro corante vital com baixos níveis de citotoxicidade podia ser as escolhas preferíveis para aplicações em que é necessária a viabilidade celular completo, tais como a cultura de células germinativas e / ou transplante de 4.
Temos sido capazes de resolver as populações de células específicas que atingiram mais de 95% de pureza, quer para as populações seleccionadas testiculares com conteúdo de DNA diferente 4 (Figura 3), ou mesmo para subpopulações com o mesmo conteúdo de ADN, mas diferentes níveis de condensação de cromatina (Figura 4). Este último pode ser feito enquanto as subpopulações de interesse podem ser individualizadas nos perfis de citometria, particularly nos gráficos de pontos. Por exemplo, até agora, nós fomos capazes de ordenar diferentes fases da cobaia meiócitos I 9, mas não para discriminar e classificar subpopulações dentro da população 2C simplesmente por coloração do ADN. Células classificadas tornaram RNA de boa qualidade, permitindo diferenciais a jusante análises de expressão gênica 9 (Figura 5).
Como pode ser visto na descrição do protocolo, é muito simples e facilmente reprodutível, e não requer pessoal especialmente qualificado. Consideramos que possa ser adoptada para uma ampla variedade de aplicações que envolvem a citometria de fluxo ou não. O primeiro intervalo de análise de conteúdo testicular simples para a rápida verificação de antecedência espermatogênese, a outros com preparativo visa como a purificação do fluxo de populações de células específicas para estudos moleculares ulteriores, como mostrado aqui.
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Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo CSIC (I + D projeto C022) e PEDECIBA. Os autores querem agradecer Mariela Bollati e Valentina Porro da Unidade de Biologia da Célula (Institut Pasteur de Montevidéu) pela colaboração generosa sobre o classificador de células MoFlo e Merial-Montevidéu por fornecer gentilmente todos os espécimes de cobaias utilizadas neste projeto. Figura 1 foi reproduzido com permissão do BioMed Central; Figuras 2 e 3, e na Tabela 1, com permissão de S. Karger AG, Basel e Figuras 4 e 5 foram reproduzidos ou adaptados com permissão de John Wiley & Sons, Inc (direitos autorais de propriedade da Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| H–chst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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