Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen
Summary
Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.
Abstract
Mammalian Hoden sehr komplexe Organe, die mehr als 30 verschiedenen Zelltypen, einschließlich somatischen Zellen und Hoden verschiedenen Stadien der Keimbahn-Zellen enthalten. Diese Heterogenität ist ein wichtiger Nachteil bezüglich der Studie von den Basen der Säuger Spermatogenese, als reiner oder angereicherter Zellpopulationen in bestimmten Stadien der Entwicklung der Spermien für die meisten molekularen Analysen 1 benötigt.
Verschiedene Strategien wie Staput 2,3, zentrifugale Elutriation 1 und Durchflusszytometrie (FC) 4,5 wurden eingesetzt, um angereichert oder gereinigt Hoden Zellpopulationen zu erhalten, um differentiellen Genexpression Studien zu ermöglichen.
Es ist erforderlich, dass die Zellen in Suspension für die meisten Anreicherung / Reinigung möglich sind. Im Idealfall wird die Zellsuspension werden Vertreter des ursprünglichen Gewebes, haben einen hohen Anteil an lebensfähigen Zellen und nur wenige multinucleates – die dazu neigen, wegen der Form,Syncytial Natur des Samenepithels 6,7 – und der Mangel Zellklumpen 1. Frühere Berichte hatten bewiesen, dass Hoden Zellsuspensionen von einem ausschließlich mechanischen Verfahren hergestellt leichter verklumpt als diejenigen trypsinierten 1. Auf der anderen Seite, enzymatische Behandlungen mit RNasen und / oder Disaggregation Enzyme wie Trypsin und Collagenase führen zu Makromolekülen Abbau, was für die bestimmten Downstream-Anwendungen ist. Der ideale Prozess sollte so kurz wie möglich und beinhalten minimale Manipulation, um so eine gute Erhaltung der Makromoleküle von Interesse, wie mRNAs zu erreichen. Diese Protokolle zur Herstellung von Zellsuspensionen aus festen Geweben sind in der Regel zeitaufwendig, sehr bedienerabhängige und wahlweise beschädigen bestimmten Zelltypen 1,8.
Das Protokoll hier vereint die Vorteile einer hoch reproduzierbar und extrem kurzen mechanischen Aufschluss mit dem einbsence der enzymatischen Behandlung, was eine gute Qualität Zellsuspensionen, die für die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung 4 und anderweitige Genexpressionsstudien 9 verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die optimierte hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung von Zellsuspensionen aus Nagetier Hodengewebe in einem sehr schnellen und reproduzierbaren Weise vermeiden Enzym und Reinigungsmittel Behandlung und das Beibehalten der guten Integrität der Zelle und Art Proportionen. Die Kürze des Verfahrens (die 15 min Spannweite umfasst Hoden Dissektion, Schneiden von Gewebe und Verarbeitung), Aufwand ist minimal, und das Fehlen von enzymatischen Behandlungen sind nur einige der wichtigsten Vorteile. All dies w?…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch CSIC (I + D Projekt C022) und PEDECIBA unterstützt. Die Autoren wollen Mariela Bollati und Valentina Porro aus der Zellbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) danken für die großzügige Zusammenarbeit über die MoFlo Zellsortierer und Merial-Montevideo für sanft bietet alle Meerschweinchen Proben in diesem Projekt verwendet. Abbildung 1 Abbildungen 2 und 3 und Tabelle 1 mit Genehmigung der S. Karger AG, Basel;; wurde mit freundlicher Genehmigung von BioMed Central reproduziert und die Abbildungen 4 und 5 wurden reproduziert oder mit Genehmigung von John Wiley & Sons, Inc. (Copyright im Besitz angepasst Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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