Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari
Summary
Un nuovo protocollo per la preparazione meccanica di sospensioni di cellule testicolari di materiale roditore, evitando enzimi e detergenti, è descritto. Il metodo è molto semplice, veloce, riproducibile, e rende sospensioni cellulari di buona qualità, che sono adatti per il flusso di smistamento e l'estrazione di RNA.
Abstract
Testicoli di mammiferi sono organi molto complessi che contengono più di 30 diversi tipi di cellule, tra cui le cellule somatiche testicolari e le diverse fasi di cellule germinali. Questa eterogeneità è un importante svantaggio riguarda lo studio delle basi della spermatogenesi mammiferi, poiché sono necessari popolazioni pure o arricchito di cellule in determinate fasi dello sviluppo sperma per la maggior parte delle analisi molecolari 1.
Strategie diverse quali Staput 2,3, elutriazione centrifuga 1, e citometria a flusso (FC) 4,5 sono stati impiegati per ottenere popolazioni di cellule testicolari arricchiti o purificata per consentire studi di espressione genica differenziale.
E 'necessario che le celle siano in sospensione per la maggior parte degli approcci arricchimento / purificazione. Idealmente, la sospensione cellulare sarà rappresentativo del tessuto originale, hanno una elevata percentuale di cellule vitali e poche multinucleates – che tendono a formare a causa dellanatura sinciziale dell'epitelio seminifero 6,7 – e grumi di cellule mancanza 1. I rapporti precedenti hanno evidenziato che le sospensioni di cellule testicolari preparati da un metodo esclusivamente meccanico aggregata più facilmente di quelli trypsinized 1. D'altra parte, trattamenti enzimatici con RNasi e / o disaggregazione enzimi come tripsina e collagenasi porterebbe al degrado macromolecole specifico, che è indesiderabile per determinate applicazioni a valle. Il processo ideale dovrebbe essere il più breve possibile e coinvolgere manipolazione minima, in modo da realizzare una buona conservazione delle macromolecole di interesse come mRNA. Protocolli attuali per la preparazione di sospensioni cellulari da tessuti solidi sono solitamente richiede tempo, fortemente operatore-dipendente, e possono danneggiare selettivamente alcuni tipi di cellule 1,8.
Il protocollo presentato qui combina i vantaggi di una disaggregazione meccanica altamente riproducibile ed estremamente breve con l'unabsence di trattamento enzimatico, portando a sospensioni cellulari di buona qualità che possono essere usati per l'analisi di citometria di flusso e di smistamento 4, e ulteriori studi di espressione genica 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto ottimizzato consente la preparazione di sospensioni di cellule da tessuto testicolare roditore in modo molto veloce e riproducibile, evitando enzima e detersivo trattamento e mantenere una buona integrità delle cellule e di tipo proporzioni. La brevità della procedura (il minimo campata 15 include la dissezione testicolo, il taglio dei tessuti, e la lavorazione), una minima manipolazione coinvolto, e l'assenza di trattamenti enzimatici sono alcuni dei principali vantaggi. Tutti questi sareb…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal CSIC (I + D progetto C022) e PEDECIBA. Gli autori desiderano ringraziare Mariela Bollati e Valentina Porro dall'Unità Biologia Cellulare (Institut Pasteur de Montevideo) per la loro generosa collaborazione concernente il cell sorter MoFlo e Merial-Montevideo per fornire delicatamente tutti gli esemplari cavia utilizzati in questo progetto. Figura 1 è stato riprodotto con il permesso di BioMed Central, figure 2 e 3, e la Tabella 1 con il permesso di S. Karger AG, Basilea, e figure 4 e 5 sono stati riprodotti o adattati con il permesso di John Wiley & Sons, Inc (copyright di proprietà di Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
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