Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği
Summary
Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.
Abstract
Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler 1 için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var.
Bu Staput 2,3, santrifüj elutrasyon 1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) 4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır.
Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması – çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri 1 – seminifer epitel 6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar 1'den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi 1,8 zarar verebilir.
Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama 4 ve art gen ekspresyon çalışmaları 9 için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem …
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen CSIC (I + D proje C022) ve PEDECIBA tarafından desteklenmiştir. Yazarlar yavaşça bu projede kullanılan tüm kobay örnekler sağlamak için MoFlo hücre sıralayıcı ve Merial-Montevideo ile ilgili cömert işbirliği için Hücre Biyolojisi Birimi (Institut Pasteur de Montevideo) den Mariela Bollati ve Valentina Porro teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1 Şekil 2 ve 3, ve S. Karger AG, Basel izni ile Tablo 1,, BioMed Central izni ile yeniden ve Şekil 4 ve 5 John Wiley & Sons, Inc (ait telif hakkı izni ile çoğaltılamaz veya uyarlandı Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
