Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen
Summary
Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.
Abstract
Zoogdieren testes zijn zeer complexe organen die meer dan 30 verschillende soorten cellen, waaronder somatische testiculaire cellen en de verschillende stadia van germlinecellen bevatten. Deze heterogeniteit is een belangrijk nadeel met betrekking tot de studie van de grondslagen van zoogdieren spermatogenese, zoals zuivere of verrijkte celpopulaties in bepaalde stadia van spermaontwikkeling nodig voor twee moleculaire analyses 1.
Verschillende strategieën zoals Staput 2,3 centrifugale elutriatie 1 en flowcytometrie (FC) 4,5 zijn gebruikt om verrijkte of gezuiverde celpopulaties testicular verkrijgen om differentiële genexpressie studies mogelijk.
Het is vereist dat cellen in suspensie meeste verrijking / zuivering benaderingen. Idealiter zal de celsuspensie vertegenwoordiger van het oorspronkelijke weefsel, een hoog percentage levensvatbare cellen en enkele multinucleates – die meestal gevormd door desyncytieel aard van de seminifereus epitheel 6,7 – en gebrek celklonten 1. Eerdere rapporten had aangetoond dat testiculaire celsuspensies bereid door een uitsluitend mechanische methode samengeklonterd gemakkelijker dan getrypsiniseerde degenen 1. Anderzijds, enzymatische behandelingen met RNAsen en / of disaggregeren enzymen zoals trypsine en collagenase leiden tot specifieke macromoleculen afbraak, hetgeen ongewenst is voor bepaalde verdere toepassingen. De ideale proces moet zo kort mogelijk zijn en op minimaal manipulatie, teneinde een goede bewaring van macromoleculen plaats zoals mRNA bereiken. Huidige protocollen voor de bereiding van celsuspensies van vaste weefsels gewoonlijk tijdrovend, sterk afhankelijk van de operator, en kunnen selectief beschadigen bepaalde celtypen 1,8.
De hier gepresenteerde protocol combineert de voordelen van een zeer reproduceerbare en uiterst korte mechanische disaggregatie met eenbsence enzymatische behandeling, wat leidt tot goede kwaliteit celsuspensies die kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyse en sortering 4 en latere genexpressiestudies 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geoptimaliseerde hier beschreven methode maakt de bereiding van celsuspensies van knaagdieren testisweefsel in een zeer snelle en reproduceerbare wijze voorkomen enzym en detergensbehandeling en onderhouden goede celintegriteit en soort verhoudingen. De korte duur van de procedure (de 15 min overspanning omvat testis dissectie, weefsel snijdende en verwerking), minimaal hanteren van toepassing en geen enzymatische behandelingen zijn enkele van de belangrijkste voordelen. Al deze goed zijn voor de goede conservering v…
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door CSIC (I + D project C022) en PEDECIBA. De auteurs willen Mariela Bollati en Valentina Porro bedanken van de Celbiologie Unit (Institut Pasteur de Montevideo) voor hun genereuze medewerking betreffende het MoFlo celsorteerder, en Merial-Montevideo voor zacht verstrekken van alle cavia exemplaren gebruikt in dit project. Figuur 1 werd gereproduceerd met toestemming van Biomed Central, figuren 2 en 3, en tabel 1 met toestemming van S. Karger AG, Basel, en de figuren 4 en 5 werden gereproduceerd of aangepast met toestemming van John Wiley & Sons, Inc (copyright in handen van Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
