تقنيات بسيطة وفعالة لإعداد تعليق خلية الخصية
Summary
يوصف بروتوكول رواية لإعداد الميكانيكية من الايقاف الخلية الخصية من المواد القوارض، وتجنب الانزيمات والمنظفات و. طريقة بسيطة جدا وسريعة، واستنساخه، ويجعل جيدة الايقاف الخلية الجودة، والتي هي مناسبة لتدفق الفرز واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
الخصيتين الثدييات هي الأجهزة المعقدة جدا التي تحتوي على أكثر من 30 أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجسدية الخصية ومراحل مختلفة من الخلايا الجرثومية. هذا التباين هو العيب هامة تتعلق بدراسة أسس تكوين الحيوانات المنوية لدى الثدييات، كما هناك حاجة السكان الخلية نقية أو المخصب في مراحل معينة من تطور الحيوانات المنوية لمعظم التحليلات الجزيئية 1.
استراتيجيات مختلفة مثل Staput 2،3، تصويل الطرد المركزي 1، والتدفق الخلوي (FC) 4،5 وقد استخدمت للحصول على السكان الخلية الخصية المخصب أو تنقيته من أجل تمكين دراسات التعبير الجيني التفاضلي.
هو مطلوب منها أن الخلايا هي في تعليق لمعظم النهج تخصيب / تنقية. من الناحية المثالية، فإن تعليق خلية تكون ممثلة من النسيج الأصلي، لديها نسبة عالية من خلايا قابلة للحياة وقليلة multinucleates – التي تميل إلى تشكيل لللطبيعة المخلوي من ظهارة المنوية 6،7 – وعدم وجود كتل الخلية 1. وكانت تقارير سابقة يتضح أن الايقاف الخلية الخصية باستخدام أسلوب الميكانيكية حصريا على استعداد تجمعت أكثر سهولة من تلك trypsinized 1. من ناحية أخرى، والعلاجات الأنزيمية مع RNAses و / أو الأنزيمات تفصيل مثل التربسين وكولاجيناز تؤدي إلى تدهور الجزيئات محددة، وهو غير مرغوب فيه لبعض التطبيقات المصب. وينبغي أن تكون عملية مثالية قصيرة قدر الإمكان وتتطلب الحد الأدنى من التلاعب، وذلك لتحقيق الحفاظ جيدة من الجزيئات ذات الأهمية مثل mRNAs و. البروتوكولات الحالية لإعداد تعليق خلية من الأنسجة الصلبة وعادة ما تكون تعتمد على المشغل تستغرق وقتا طويلا، إلى حد كبير، وربما تلف انتقائي بعض أنواع الخلايا 1،8.
بروتوكول المعروضة هنا يجمع بين مزايا تصنيفها الميكانيكية استنساخه للغاية وجيزة للغاية مع أحدbsence العلاج الأنزيمية، مما أدى إلى تعليق خلية جيدة الجودة التي يمكن استخدامها لتحليل تدفق cytometric والفرز 4، ودراسات التعبير الجيني خفية 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الأمثل هو موضح هنا يمكن إعداد تعليق خلية من القوارض أنسجة الخصية بطريقة سريعة جدا وقابلة للتكرار، وتجنب انزيم المنظفات والعلاج والمحافظة على سلامة الخلية جيد ونوع النسب. الاختصار في الإجراء (تشمل 15 دقيقة تمتد تشريح الخصية، وقطع الأنسجة، والتصنيع)، والحد الأ…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل CSIC (I + D المشروع C022) وPEDECIBA. الكتاب أود أن أشكر مارييلا Bollati وفالنتينا بورو من وحدة بيولوجيا الخلية (معهد باستور دي مونتيفيديو) لتعاونهم السخي بشأن فارز الخلية MoFlo، وميريال-مونتفيديو لتوفير بلطف جميع العينات خنزير غينيا المستخدمة في هذا المشروع. الشكل 1 وقد استنسخ بإذن من بيوميد الوسطى؛ الشكلين 2 و 3، والجدول 1 بإذن من S. KARGER AG، بازل، وأرقام 4 و 5 استنسخت أو تكييفها مع إذن من جون وايلي وأولاده، وشركة (حقوق الطبع والنشر التي يملكها ايلي بلاكويل، 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
References
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
