Summary
Se describe un modelo de contusión de la lesión medular grave. Medidas pre-operatorio, operatorio y post-operatorio detalladas se describen para obtener un modelo coherente.
Abstract
El potencial de la traducción de nuevos tratamientos debe ser investigado en lesiones graves de la médula espinal (SCI) modelos contusión. Una metodología detallada se describe para obtener un modelo consistente de severa SCI. El uso de un marco estereotáctico y impactador controlado por ordenador permite la creación de lesión reproducible. La hipotermia y las infecciones del tracto urinario representan retos significativos en el período post-operatorio. Monitoreo cuidadoso de los animales con la grabación diaria de peso y la expresión de vejiga permite la detección precoz de las complicaciones post-operatorias. Los resultados funcionales de este modelo contusión son equivalentes a los modelos de transección. El modelo de contusión se puede utilizar para evaluar la eficacia de ambos enfoques neuroprotectores y neuroregenerativos.
Introduction
Elección del modelo de lesión adecuada es fundamental para la evaluación preclínica de nuevos tratamientos para lesiones de la médula espinal (SCI). 1,2,13 En una reciente encuesta de los médicos y científicos en el campo de la modelo contusión neurotrauma, a diferencia de los modelos de transección completa hemisección o , fue universalmente aceptado para ser clínicamente relevante. 8 Esta opinión se basa en la observación de que la mayoría de las lesiones de la médula espinal en los seres humanos es contusa en la naturaleza. 10 La biología de contusión también parece ser diferente de los modelos de hemisección o transección. 11 Iseda, et al. comparó el efecto de la inyección intraespinal condroitinasa ABC en neuroregeneración por separado en los modelos de contusión y hemisección. 4 regeneración axonal se observó en el puente neuronal en hemisección pero no el grupo SCI contusión. Los modelos transección completa hemisección o también crean las condiciones conocidas en sólo un pequeño subconjunto de clcircunstancias inical. Por ejemplo, varios investigadores han empleado intervenciones andamio basados para la implantación en la cavidad de la lesión después de la hemisección o transección completa para promover la regeneración. 6 Este enfoque se vuelve clínicamente irrelevantes porque la creación de una cavidad dentro de la médula espinal lesionada es poco práctico y probablemente no ética.
La variabilidad en la recuperación funcional sigue siendo un desafío importante para los modelos de contusión. 5,12 Esta variabilidad puede ser minimizado mediante el uso de impactador controlado por ordenador y la estabilización de la columna vertebral antes del impacto para la entrega de fuerza uniforme en todo el volumen de la médula espinal en especial las vías motoras situadas ventralmente . Debe tenerse en cuenta que la plasticidad y la contribución garantía de axones supervivientes es el mecanismo predominante de la recuperación después de lesión de la médula espinal. 1 Por lo tanto, incluso variaciones menores en la técnica de contusión pueden producir resultados significativamente diferentes. Con este fin hemos desarrolladoun modelo de lesión medular severa que produce contusión volumen constante y la recuperación funcional comparable con los modelos de transección. Este modelo puede ser utilizado tanto para la investigación de la neuroprotección y estrategias Neuroregeneración como una prueba de concepto para la eficacia del tratamiento.
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Protocol
1. Preparación Antes de una Lesión de la Médula Espinal
Los instrumentos quirúrgicos necesarios para este procedimiento son bisturí, pastillas con o sin dientes, hemostáticos, retractores de auto contención, gubias punta fina, conductor de agujas, suturas absorbibles y aplicadores del clip de piel. Otros suministros quirúrgicos requeridos son paños quirúrgicos, sábanas estériles para campo quirúrgico, esponjas de gasa, aplicadores con punta de algodón, y papel metálico. Esterilizar en autoclave los instrumentos quirúrgicos y suministros antes de la cirugía. Utilice el conjunto individual de instrumentos y suministros para un animal. Limpie el área de la cirugía y aparatos (impactador, fuente de luz, marco estereotáctico, grano de cristal esterilizadores y almohadillas térmicas) con toallitas con alcohol.
Abra las cortinas quirúrgicas y el uso de guantes estériles para cubrir el campo quirúrgico evitando cuidadosamente contaminación. Abra los instrumentos individuales estéril y colocar cuidadosamente los del campo quirúrgico. Cubra los pomos y tiradores de thaparato de correo probable necesario durante el procedimiento con la lámina metálica estéril. Encender la perla esterilizador de vidrio para estar listo para su uso durante el procedimiento.
2. Preparación de los animales
Llevar las ratas a la zona de laboratorio pocas horas antes de que el procedimiento real. Administrar medicamentos para el dolor, al menos, una hora antes del procedimiento previsto (normalmente buprinorphine 1,5 ml de 0,006 mg / ml por vía subcutánea). Administrar antibióticos preoperatorios (típicamente Baytril 4 mg / kg por vía subcutánea). Anestesie las ratas con 90 mg / kg de ketamina y esperar hasta que no haya respuesta toe-pinch. Se palpa la apófisis espinosa más prominente en la columna torácica. Este nivel se corresponde normalmente con T10 apófisis espinosa. Marque la ubicación del nivel previsto en relación con T10. En nuestro laboratorio realizamos una lesión en T10. El siguiente relato describe la técnica de T10 SCI. Afeitado a 3 cm x 6 cm rectángulo longitudinal y centrada a nivel de T10. Limpie la piel tres veces wisolución de Betadine th. Aplicar lubricante oftálmica en cada ojo. Transferir la rata en una posición cómoda para el campo quirúrgico evitando cuidadosamente la contaminación. Inserte una sonda de temperatura rectal para monitorear la temperatura del núcleo y ajustar en consecuencia el calentamiento para mantener la temperatura animales como cerca de lo normal (~ 37,5 ° C) como sea posible. Cubrir la rata con un paño quirúrgico con una ventana por encima de la zona quirúrgica.
3. Procedimiento quirúrgico
Comience con un aproximado de 4 cm incisión utilizando una cuchilla # 10 centrado en la marca de T10. Proceda a diseccionar pacientemente fascia y capas musculares lejos de las T9-T11 apófisis espinosas y las láminas. Coloque retractores para retraer el músculo y la fascia lejos del hueso. Mientras que la estabilización de la apófisis espinosa de T9 fuertemente dividir el ligamento interespinoso entre T9 y T10 con unas tijeras finas. Del mismo modo estabilizar la apófisis espinosa T10 y dividir el ligamento interespinoso entre T10-T11. Utilice ampliación bucle para complementarte la división de los ligamentos de todo el camino a través del ligamento amarillo (Figura 1). El saco tecal es fácilmente evidente una vez que el ligamento amarillo se desconecta. Utilice gubia de punta fina para realizar cuidadosamente laminectomía fragmentario bilateral en T10. Se toma el máximo cuidado para evitar una presión a la baja sobre el saco tecal y lesión inadvertida de las puntas gubia. La lámina y apófisis espinosa de T10 se elimina por completo.
Mueva el animal en su posición en la plataforma de estabilización. Use abrazaderas estabilizadores para inmovilizar la columna vertebral de sujeción por los aspectos laterales del cuerpo vertebral T11 seguido por los aspectos laterales del cuerpo vertebral T9. Tenga cuidado de no comprimir la rata en la plataforma con las abrazaderas estabilizadoras ya que esto limitaría el espacio para los movimientos respiratorios y añadir estrés no deseado del animal. Después de asegurar se comprueban la configuración de columna vertebral en el impactador controlado por ordenador. Normalmente usamos punta impactador de 3,0 mm a una speed de 4 cm / s, con una profundidad de 2 mm y un tiempo de permanencia de 0,3 segundos. Extienda la punta del péndulo y bajarlo hasta que toque la superficie dorsal. Retirar la punta y bajar el dispositivo de 2 mm hacia la superficie de la médula espinal. Suelte pistón en 4 cm / s para causar contusión lesión medular grave. Lograr la hemostasia utilizando sólo la presión suficiente para mantener el aplicador de punta de algodón en el lugar, teniendo cuidado de no crear una presión innecesaria sobre el cable. Sutura del músculo y las capas de la fascia con una sutura en forma de 8 con cuidado de no tirar de la muy apretada con suturas absorbibles. Cierre la piel con un mínimo de 2 pequeñas grapas, puede tener hasta 4 o 5 grapas pueden usarse si las partes de la incisión permanecen abiertos después de las primeras 2 o 3 grapas.
3. Cuidados después del procedimiento
Ratas en un ambiente cálido de unos 33 a 35 ° C durante 24 horas después de la cirugía. Esto implica una incubadora (mientras están inconscientes) y un espacio de jaula climatizada, una vez que comienzan a moverse. Una vez que las ratas son completamente awome, administrar 5 ml de solución salina, 1,5 ml (0,006 mg / ml) de buprinorphine, y 0,1 ml de Baytril todo por vía subcutánea. Continúe con buprinorphine subcutánea dos veces al día para el primer 24-48 hy Baytril una vez al día durante 7 días. Las vejigas deben expresarse manualmente tres veces al día hasta el regreso de la función de la vejiga (<2 ml de orina en la expresión temprano por la mañana durante 3 días consecutivos). Los animales también deben ser revisados durante este tiempo de infección (sangre en la orina, color blanquecino o mal olor), disminución de la actividad física o los problemas con la cicatrización de la herida. La presencia de la infección debe ser contrarrestado con un aumento de la dosis (o reinicio) de antibióticos en consulta con los veterinarios locales. Pesar ratas comienzan diario el día después de la cirugía para evaluar su recuperación.
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Representative Results
Volumen de la lesión
Hemos obtenido grandes volúmenes de la lesión y coherente siguiendo la técnica descrita anteriormente. El uso de un Luxol rápido tinción con azul de un volumen de la lesión media de 2,04 mm 3 (IC del 95% 01.09 hasta 02.18) (n = 5 animales) se obtuvo. Figura 2 muestra significa volumen de la lesión con una tinción representativa utilizando azul rápido Luxol a través de la lesión epicentro.
Las puntuaciones funcionales
Las puntuaciones de comportamiento, medida por la escala de Bresnahan (BBB) Basso, Beattie, se muestran en la Figura 3. A las 12 semanas, las ratas del grupo de control logró una puntuación de 2,2 ± 1,1 (n = 10 animales) la acreditación media.
Otros Parámetros
Basándonos en nuestra experiencia más reciente con 32 cirugías animales la tasa de supervivencia de esta técnica es del 93,4%. Todas las mortalidades estaban relacionados con infección del tracto urinario persistente (ITU), seguido de sacrificio de animales para evitar dolor y sufrimiento excesivo. Al terminar el curso de antibióticos durante 7 días 16.7% animales desarrollaron IVU. El número medio de días para la detección de infección urinaria post-operatoria fue de 14,6 ± 7,6 días. Curiosamente los animales logran control de la vejiga en un promedio de 13 días después de la lesión (media 13,33 ± 3,6 días). Las ratas que desarrollaron UTI tomó más tiempo para lograr control de la vejiga en comparación con las ratas sin UTI (control de la vejiga en ratas con IU - 16 ± 1 días frente a 12,8 ± 3,7 días para el control de la vejiga en ratas sin UTI, p = 0,03). En la cohorte que alcanza control de la vejiga dentro de 14 días no se detectó ninguna infección urinaria posterior. Como se muestra en la Figura 4, se produjo un aumento inicial en el peso después de la lesión probablemente de la retención de líquidos. El peso se redujo posteriormente y se estabilizó a un nivel inferior (aproximadamente 10 a 12% más bajo que línea de base) en unos 10 días.
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Figura 1. Anatomía vertebral de rata desde el abordaje posterior (a la izquierda) que demuestra las apófisis espinosas y las láminas. La posición del ligamento amarillo (LF) se representa en el espacio entre las láminas. La sección media sagital-(derecha) que muestra la posición relativa del ligamento amarillo y el ligamento interespinoso en relación a la médula espinal.
Figura 2. Gráfico de barras que muestra el volumen de lesión (en mm 3, eje Y) en los animales que recibieron la lesión medular grave (izquierda). Una sección longitudinal a través de representante epicentro lesión después de la tinción de azul rápido Luxol (derecha).
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Figura 3. BBB puntuación de las ratas (eje Y) en el transcurso de 3 meses de seguimiento (eje X) demostrando recuperación mínimo típico de graves SCI media.
La Figura 4. Diagrama de línea que muestra la variación de peso al día (en g, eje Y) de las ratas más de 2 semanas de duración (eje X) después de la inducción de la lesión de la médula espinal.
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Discussion
Varios nuevos tratamientos han demostrado recientemente promesa temprana en el campo de la investigación SCI. 3 La evaluación cuidadosa de estos tratamientos es esencial en el modelo clínicamente relevante de SCI para seleccionar estrategias con potencial de traslación máxima. Un esquema de clasificación fue desarrollado recientemente para evaluar la fuerza de los estudios preclínicos. 9 Este esquema hizo hincapié en la importancia de utilizar modelos contusión severa SCI. Aquí se describe un modelo tan contusión severa SCI con volúmenes de lesión consistentes y resultados funcionales similares a las de los modelos de transección. Este modelo puede ser utilizado como una 'prueba de concepto' para establecer la eficacia del tratamiento tanto para la neuroprotección y estrategias neuroregeneración.
La generación de uniforme contundente SCI sigue siendo un reto. Para la reproducibilidad, es esencial que la lesión se lleva a cabo lo más uniformemente posible. El nivel previsto de la médula espinal se debe identificar sistemáticamente from un animal a otro. La extracción del hueso durante laminectomía debe hacerse con cuidado para asegurar que no queden fragmentos de hueso en la médula espinal, los cuales podrían causar daños por compresión e introducir variaciones no deseadas en los mecanismos de lesión y el potencial de recuperación. Hemos adoptado una serie de medidas para garantizar la uniformidad incluyendo el tamaño del impactador, la estabilización de la columna vertebral rígida sobre un bastidor de montaje con los brazos estabilizadores, utilizando una velocidad de impacto uniforme y profundidad del impacto. Es importante que la rata se coloca cómodamente cuando los fórceps se sujetan a la estabilización de los cuerpos vertebrales. Cualquier variación en la alineación de la columna o el exceso de estrés durante el pinzamiento pueden alterar la biomecánica del impacto. Se utilizó un impactador de 2,5 mm ya que el tamaño promedio de la médula espinal de ratas en nuestra región de interés es 2,5-3 mm. El tiempo de contacto o permanencia se estableció uniformemente a 0,3 seg en nuestros experimentos. Sin embargo, en nuestra observación y los informes de otros laboratorios, para un modelo de SCI severa la profundidad de impacto es la más crucialparámetro. En los experimentos descritos en este documento, el impacto fue entregado a una profundidad constante de 2 mm. Otros factores que afectan la uniformidad de capacitación de personal, la visualización clara de los tejidos, y la punta del impactador para asegurar un impacto directo en el tejido de la médula (y no las estructuras óseas).
Las ratas deben ser constantemente observada durante el procedimiento de signos vitales necesarios más importante de temperatura central y la respiración. La hipotermia es la principal causa de mortalidad durante e inmediatamente después de la administración de anestesia. Control de temperatura del núcleo con la sonda rectal y almohadillas térmicas apropiadas evitará esta complicación. Si la respiración se hace irregular o el animal deja de respirar, el procedimiento debe suspenderse inmediatamente hasta que la respiración vuelve a la línea de base. El dolor excesivo o inadvertida y más de la dosis de dolor y la medicación anestésica también pueden dar lugar a problemas respiratorios. Las ratas deben ser vigilados cuidadosamente después del procedimiento. Su wochos deben medirse con precisión y una pérdida de> 20% del peso inicial debe impulsar una investigación sobre la alimentación y la ingesta de agua, infección del tracto urinario, lesiones en la piel, post-SCI íleo, etc La consulta temprana con el personal veterinario para la evaluación y el tratamiento es crucial en tales situaciones. Como se señaló anteriormente, las ratas que no han recuperado el control de la vejiga durante el día 14 se debe comenzar de nuevo con antibióticos para evitar una infección potencialmente mortal del tracto urinario.
Lesión de la médula espinal puede ser inducida por ya sea un método de desplazamiento o el método de fuerza constante. 5,12 La técnica descrita en este documento es el método de desplazamiento en donde se entrega la fuerza a la profundidad fija dentro del tejido de la médula espinal. El uso de un impactador controlado por ordenador permite un nivel de control que no es alcanzable por los otros métodos comunes de SCI experimental. La técnica de compresión clip no permite una fuerza contundente romo con liberación inmediata, mientras que el impacto Universidad de Nueva Yorko depende de la gravedad para determinar la fuerza de contusión. Estas técnicas, aunque reproducible, no permiten la simulación de las condiciones encontradas durante un accidente de vehículo de motor, la causa más común de la lesión medular aguda en los seres humanos. Estudios previos han demostrado que la gravedad de la lesión se correlaciona directamente con la profundidad de impacto que la velocidad de impacto. 7 Por lo tanto, este modelo permite una severa SCI para ser realizada de forma rutinaria con el potencial de modificar la gravedad a través de una mayor gama de combinaciones de fuerza y el desplazamiento .
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Disclosures
No divulgación de información financiera
Ninguna revelación financiación.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. N. Banik y el Dr. D. Mitchell por su orientación en el desarrollo de este modelo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
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