Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli
Summary
Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.
Abstract
Mesane kanseri ürogenital sistem ve nüks ve ilerleme ihtiyaç vardır azaltabilir yeni terapötik yaklaşımların en sık görülen ikinci kanser türüdür. Tümör mikro önemli ölçüde tümör gelişimini ve tedavi yanıtı etkileyebilir. Bu kaynaklandıkları organda tümör hücrelerinin büyümesini bu nedenle sık sık istenmektedir. Bu protokol MB49 kemirgen hücreleri, mesane karsinomu kateterizasyon ile torbasına damlatılır edildiği, mesane kanseri ortotopik bir model tanımlar. Bu modelde başarılı tümör hücre implantasyonu, fiziksel ya da kimyasal yollarla gerçekleştirilebilir koruyucu glikozaminoglikan tabakası, bozulması gerektirir. Protokolde mesane önce hücre damlatma için tripsin ile muamele edilmektedir. Mesane kateterizasyonu da tümörler oluştuğunda kez terapötik sunmak için de kullanılabilir. Bu protokol, bir lusiferaz raportör geni ifade eden bir adenoviral konstruktun teslimat açıklanmaktadır. O süreur protokol kısa süreli çalışmalar için optimize edilmiş ve gen teslimat odaklanmaktadır olmuştur, fare mesane kateterizasyonu metodoloji geniş uygulamaları vardır.
Introduction
Mesane kanseri 2012 1. beklenen yaklaşık 75,000 yeni vaka ve 15.000 ölüm ile ürogenital sistemin en sık görülen ikinci kanser türüdür. Nüks oranlarının yüksek mesane kanseri tedavisinde pahalı kanserlerin biri yapar ömür boyu takip gerektirir. Kas tabakası işgal etmiştir Mesane kanseri lenf sistemi yoluyla karaciğer, akciğer veya kemik metastaz yapabilir. 5 yıl sonra sadece% 20-40 hayatta gelişmiş tümörler sonuçları multimodal tedavi. Bu nedenle, yüzeyel mesane kanseri nüks ve ilerlemesini azaltılması gibi gelişmiş hastalığı olan hastalarda tedavi sonuçlarını iyileştirmeye yönelik etkili tedavi stratejilerine acilen ihtiyaç vardır.
Yeni tedavilerin geliştirilmesi ilk in vitro değerlendirme sonrasında etkinliğini değerlendirmek için klinik öncesi modelleri gerektirmektedir. Tümör mikro ölçüde preclinic ihtiyacını vurgular ki, kanser gelişimi ve yanıt etkileyebilirtümörler ortaya edildiği veya buna al modelleri kökenli organda kurulabilir. Bir yaklaşım, tümörler, kendiliğinden ortaya çıkan ya da bir organa özgü bir şekilde indüklenebilir transgenik model geliştirilmesidir. Transjenik bir mesane kanseri modelinde mükemmel bir protokol son 2 yayınlanmıştır. Transgenik modellerin dezavantajı tümörler yavaş ve istenenden daha az tekdüzelik ile geliştirme eğiliminde olmasıdır. Buna ek olarak, bir üreme koloni korumanın maliyeti göz önünde bulundurulmalıdır. Transgenik model için alternatif bir ticari olarak temin edilebilir, farelerde tümör kurulması için kısa zaman dilimlerinde yararı vardır tümör hücrelerinin implantasyonu ortotopik vardır. Bazı insan mesane kanseri hücre çizgileri orthotopically yetiştirilebilir da (başarılı UM-UC-3 kullanmış), bu bağışıklığı yeterli farelerde tümörler oluşturmak için arzu edilebilir. Orthotopically büyümesi iki kemirgen mesane kanseri hücre çizgileri, MBT-2 ve MB49 3 bulunmaktadır. MBT-2 hücreleri çoğaltılıyor ile kontamine olduğundanC retrovirüsü 4 yazın, biz çalışmalar için MB49 hücreleri seçtiniz. Bu MB49 hücreleri, erkek fare izole edilmiş ve ortotopik implantasyonları dişi farelerde yapılan anatomik nedenlerle vardır edildi olduğunu not etmek önemlidir. Bu Y kromozomunun belirteçleri tarafından nakledilen hücrelerin kolay tanımlanması yararı vardır, ancak toplumsal cinsiyet uyumsuzluğu immünolojik çalışmalar için bir dezavantaj olabilir.
Mesane epitel mikroorganizmaların enfeksiyonu için bir bariyer olarak işlev gören bir glikozaminoglikan (GAG) tabakası ile kaplı olduğu. Bu bariyer, bu zorluk (Tablo 1) üstesinden gelmek için geliştirilmiştir tümör hücreleri ve çeşitli yöntemler implantasyonu engelleyebilir. Elektrokoter GAG tabaka 5-13 ve bir protokol gösteren elektro-son Jüpiter 14 yayınlanmıştır bozmak için fiziksel bir araç olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ancak, elektrokoter birim mevcut olmamalı, kimyasal G yok etmek anlamına gelirÖrneğin gümüş nitrat ya da poli-L-lisin gibi AG tabakası, aynı zamanda 15-24 de kullanılabilir. Tümörler, bir gümüş nitrat küçük bir hacme mesane kısa maruz kalma ile etkili kurulan (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 saniye) ya da poli-L-lisin ile uzun temas (0.1 mg / ml 100 ul 20 dakika boyunca) (Tablo 1). Burada MB49 hücre implantasyonu kolaylaştırmak için tripsin kullanan bir yöntem tarif eder.
Mesane kanseri için tedavi yaklaşımları geliştirmek amacıyla, gen terapisi önemli dikkat çekmiştir. Görüş Klinik açıdan, mesane kanseri, kolay organın erişilebilirliği ve yerel olarak yük sunmak için yeteneği, gen terapisi için ideal bir hedeftir. Mesane kanseri, gen terapisi için araştırılmıştır Viral vektörler bir onkolitik herpes simpleks virüsü 25, retrovirüs 26, canarypox virüsü 27, vaccinia virüsü, AAV ve adenoviru içerir28 s. Bizim protokolünün ikinci bölümünde, tümör hücrelerinin damlatılmasını hemen hemen aynıdır viral gönderim için bir yöntem tarif eder. Laboratuarımızda ilgi bir lusiferaz transgenini ifade adenoviral bir vektör ile biyolüminesensin yoluyla değerlendirmek gen teslimi için yeni yaklaşımların geliştirilmesi olduğunu. Bununla birlikte, mesane metodoloji kateterizasyon çeşitli maddelerin verilmesi için kullanılan ve bu nedenle geniş bir uygulama alanına sahip olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol açıklanan birincil metodoloji hücrelerin damlatılması veya mesane epiteline yerel teslimat için tasarlanmış herhangi bir ajan için geniş uygulamalara sahip fare mesane kateterizasyonu, olduğunu. Yukarıda özetlenen spesifik protokol kısa süreli çalışmalarda (~ 10 gün) için optimize edilmiştir. Daha yüksek bir hücre sayısı nedeniyle tümör yükü için daha hızlı tümör büyümesi ve olasılıkla hayvanların kaybına neden çünkü hücrelerin implante doğru sayısı, kritik öne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH R21 CA143505 to Christina Voelkel-Johnson.
Materials
|
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
|
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
|
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
|
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
|
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
|
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
|
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
|
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
|
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
|
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
|
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
|
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
|
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
|
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
|
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
|
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).
- De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).
- Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).
- Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).
- Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).
- Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).
- Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167 (1), 357-363 (2002).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).
- Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
- Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).
- Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).
- Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
- Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).
- Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).
- Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).
- Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).
- Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).
- Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
- Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).
- Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).
- Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).
