유전자 전달 연구 동소 방광암 모델
Summary
기원의 장기에 암 세포의 주입은 새로운 치료법을 평가하는 유용한 전임상 모델이 될 수 있습니다. MB49 방광 암 세포가 방광 내 점적 다음 방광 내에서 성장시킬 수있다. 이 프로토콜은 종양 이식 및 아데노 바이러스 전달의 목적을 위해 마우스 방광 카테터를 보여준다.
Abstract
방광암은 비뇨 생식 기관 및 재발과 진행이 필요 줄일 수있는 새로운 치료 방법의 두 번째로 가장 흔한 암입니다. 종양 미세 환경은 크게 종양 발달과 치료 반응에 영향을 미칠 수있다. 그것은 그들이 시작된 장기에 종양 세포를 성장하는 것이 종종 바람직하다. 이 프로토콜은 MB49 쥐의 방광 암 세포를 카테터를 통해 방광에 주입되는 방광암의 소성을 모델에 대해 설명합니다. 이 모델이 성공적으로 종양 세포 주입이 물리적 또는 화학적 수단에 의해 달성 될 수있는 글리코 사 미노 글리 칸의 보호 층의 중단을 요구한다. 우리의 프로토콜에서 방광 전에 세포 점안에 트립신 처리됩니다. 방광의 카테터는 또한 종양이 확립되고 나면 치료제를 전달하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 루시 페라 제 리포터 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 구조의 전달을 설명합니다. O 동안UR 프로토콜 단기 연구에 최적화 및 유전자 전달에 초점을 맞추고있다, 마우스 방광 카테터 삽입의 방법은 광범위한 응용 프로그램을하고 있습니다.
Introduction
방광암 2012 년 1 예상 거의 75,000의 새로운 사례 및 15,000의 죽음과 비뇨 생식기 계통의 두 번째 가장 흔한 암입니다. 재발의 높은 비율은 방광암 치료하는 비싼 암 중 하나를 만드는 평생 추적 관찰이 필요합니다. 근육 층을 침범 방광 암은 림프 시스템을 통해 간, 폐 또는 뼈에 전이 할 수 있습니다. 오년 후 만 20-40% 생존 고급 종양 결과의 복합 치료. 따라서, 표면 방광암의 재발과 진행을 감소뿐만 아니라 고급 질환 환자의 치료 결과를 개선하기위한 효과적인 치료 전략이 절실히 필요합니다.
새로운 치료제의 개발은 초기 체외 평가를 다음과 같은 효능을 평가하는 전임상 모델을 필요로한다. 종양 미세 환경은 크게 preclinic 대한 필요성을 강조하는, 암 발생과 응답에 영향을 미칠 수있다종양이 발생하거나하는 알 모델 출신의 기관에 설립 할 수있다. 한 가지 방법은 종양이 자연적으로 발생하거나 장기 고유하게 유도 될 수있는 트랜스 제닉 모델의 개발이다. 형질 전환 방광암 모델의 우수한 프로토콜은 최근 2를 발표하고있다. 형질 전환 모델의 단점은 종양이 천천히 원하는 것보다 적은 균일 개발하는 경향이있다. 또, 번식지를 유지하는 비용을 고려하여야한다. 트랜스 제닉 모델 대안 시판 마우스에서 종양 확립 짧은 타임 프레임의 이점이 종양 세포의 동 소성 이식이다. 일부 인간 방광암 세포주 orthotopically 성장 될 수 있지만 (우리가 성공적 UM-UC-3 사용한)는 면역 적격 마우스에서 종양을 확립하는 것이 바람직 할 수있다. orthotopically 성장 두 뮤린 방광암 세포주, MBT-2 및 MB49 3이다. MBT-2 세포 복제로 오염되어 있기 때문에C 레트로 바이러스 4를 입력, 우리는 우리의 연구에 MB49 세포를 선택했습니다. 그것은 MB49 세포가 수컷 마우스에서 분리하여 소성을 착상은 암컷 생쥐에서 수행 해부학 이유입니다 된 것을주의하는 것이 중요합니다. 이것은 Y 염색체의 마커에 의해 이식 된 세포를 쉽게 식별의 장점을 가지고 있지만, 성별이 일치 면역 학적 연구를위한 단점이 될 수 있습니다.
방광 상피 세포는 미생물에 의해 감염에 대한 장벽으로 기능하는 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG) 층으로 늘어서있다. 이 장벽은이 어려움 (표 1)을 극복하기 위해 개발 된 종양 세포와 여러 가지 방법의 주입을 방해 할 수있다. 전기 소는 GAG 층 5-13 및 프로토콜을 설명하는 전기 소는 최근 조브 (14)에 게시 된을 방해하는 물리적 수단으로 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 전기 소 장치를 사용할 수 없게한다, 화학 G를 파괴하는 것을 의미한다질산은 또는 폴리-L-라이신 등 AG 층은 15-24 사용될 수있다. 종양은 질산은의 작은 양으로 방광의 짧은 노출에 의해 효과적으로 성립 (5-10 μL, 0.15-1.0 M ~ 10 초) 또는 폴리-L-라이신으로 긴 콘택트 (0.1 ㎎ / ㎖의 100 μL 20 분 동안) (표 1). 여기에서 우리는 MB49 세포의 주입을 용이하게하기 위해 트립신을 사용하는 방법을 설명합니다.
방광암 치료 방법을 개선하기위한 시도에서, 유전자 치료는 상당한 관심을 얻고있다. 보기의 임상 적 관점에서 방광 암으로 인해 쉽게 기관의 접근성 및 로컬 페이로드를 전달하는 기능을 유전자 치료를위한 이상적인 대상입니다. 방광 암 유전자 치료되었습니다 탐험 바이러스 벡터는 콜리 틱 단순 헤르페스 바이러스 25, 레트로 바이러스 26, 카나리 발진 바이러스 27, 우두 바이러스, AAV, 및 adenoviru 마련되어28의. 우리 프로토콜의 두번째 부분에서, 우리는 종양 세포의 점적 거의 동일하다 바이러스 전달하기위한 방법을 설명한다. 우리의 실험실에서 관심을 우리는 루시퍼 라제 유전자를 표현하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 생물 발광을 통해 평가 유전자 전달에 대한 새로운 접근 방식의 개발이다. 그러나, 방광 카테터 삽입의 방법은 여러 에이전트의 전달에 사용하기 때문에 광범위한 응용이 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 설명 된 기본 방법은 세포의 점안 또는 방광 상피 세포에 로컬 배달을위한 모든 에이전트에 대한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 마우스 방광의 도관이다. 위에 설명 된 특정 프로토콜 단기 연구 (일 ~ 10 일)에 최적화되어 있습니다. 높은 휴대폰 번호로 인해 큰 종양 부담이 더 빠른 종양의 성장 가능성이 동물의 손실을 초래할 것이기 때문에 세포의 정확한 수를 주입하는 것은 매…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크리스티나 VOELKEL 존슨에 NIH R21 CA143505에 의해 지원되었다.
Materials
|
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
|
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
|
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
|
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
|
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
|
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
|
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
|
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
|
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
|
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
|
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
|
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
|
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
|
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
|
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
|
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).
- De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).
- Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).
- Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).
- Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).
- Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).
- Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167 (1), 357-363 (2002).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).
- Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
- Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).
- Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).
- Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
- Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).
- Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).
- Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).
- Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).
- Luo, Y., Chen, X., O’Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).
- Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).
- Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
- Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).
- Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).
- Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).
