Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Summary

Impianto di cellule tumorali nell'organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all'interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

Abstract

Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale e nuovi approcci terapeutici che possono ridurre la recidiva e la progressione sono necessari. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo tumorale e risposta alla terapia. È pertanto spesso desiderabile crescere le cellule tumorali nell'organo da cui sono derivati. Questo protocollo descrive un modello ortotopico di cancro della vescica, in cui murine cellule di carcinoma della vescica MB49 sono instillato nella vescica tramite cateterizzazione. Impianto di cellule tumorali successo in questo modello richiede interruzioni dello strato protettivo glicosaminoglicani, che può essere effettuata con mezzi fisici o chimici. Nel nostro protocollo vescica viene trattata con tripsina prima dell'instillazione cella. Cateterizzazione della vescica può anche essere usati per fornire terapie una volta che i tumori sono stabiliti. Questo protocollo descrive la consegna di un costrutto adenovirale che esprime un gene reporter luciferasi. Mentre oprotocollo ur è stato ottimizzato per studi a breve termine e si concentra sulla consegna del gene, la metodologia di topo cateterismo vescicale ha vaste applicazioni.

Introduction

Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale con circa 75.000 nuovi casi e 15.000 decessi attesi nel 2012 ^1. Alti tassi di recidiva richiedono follow-up permanente, che rende il cancro della vescica uno dei tumori più costoso da trattare. Cancro della vescica che ha invaso lo strato muscolare può metastatizzare fegato, polmone o osso attraverso il sistema linfatico. La terapia multimodale dei tumori avanzati risultati solo nel 20-40% di sopravvivenza dopo 5 anni. Pertanto, sono urgentemente necessarie strategie di trattamento efficaci volti a ridurre la recidiva e la progressione del tumore superficiale della vescica, nonché a migliorare il risultato terapeutico nei pazienti con malattia avanzata.

Sviluppo di nuove terapie richiede modelli preclinici per valutare l'efficacia seguente valutazione iniziale in vitro. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo del cancro e la risposta, che evidenzia la necessità di preclinicoAL modelli in cui i tumori si presentano o possono essere stabiliti nell'organo di origine. Un approccio è lo sviluppo di modelli transgenici in cui i tumori sorgono spontaneamente o possono essere indotte in maniera organo-specifica. Un protocollo ottimo di un modello di cancro della vescica transgenico è stato recentemente pubblicato ^2. Lo svantaggio di modelli transgenici è che i tumori tendono a svilupparsi lentamente e con meno uniformità di quanto desiderato. Inoltre, il costo di mantenimento di una colonia di riproduzione deve essere considerato. Un'alternativa ai modelli transgenici è impianto ortotopico di cellule tumorali, che ha il vantaggio di tempi brevi per lo stabilimento del tumore nei topi disponibili in commercio. Mentre alcune linee cellulari di cancro della vescica umane possono essere coltivate ortotopicamente (abbiamo utilizzato con successo UM-UC-3), può essere auspicabile stabilire tumori in topi immunocompetenti. Due linee di cellule di cancro alla vescica murini, che crescono ortotopicamente sono MBT-2 e MB49 ^3. Poiché MBT-2 celle sono contaminati da replicaretipo C retrovirus ^4, abbiamo scelto MB49 celle per i nostri studi. È importante notare che MB49 cellule sono state isolate da un topo maschio e implantologia ortotopiche sono per ragioni anatomiche eseguite nei topi femmina. Questo ha il vantaggio di una facile identificazione delle cellule impiantate mediante marcatori del cromosoma Y, ma il disadattamento genere può essere uno svantaggio per studi immunologici.

L'epitelio vescicale è fiancheggiato da un glicosaminoglicani (GAG) strato, che funziona come una barriera per l'infezione da microrganismi. Questa barriera può anche interferire con impianto di cellule tumorali e diversi metodi sono stati sviluppati per superare questa difficoltà (Tabella 1). Elettrocauterizzazione è stato ampiamente utilizzato come un mezzo fisico di perturbare lo strato di GAG ^5-13 e dimostrando elettrobisturi protocollo è stato recentemente pubblicato in JoVE ^14. Tuttavia, se una unità elettrocauterizzazione non essere disponibile, mezzi chimici per distruggere il GAG strato come il nitrato di argento o poli-L-lisina può essere utilizzato anche ^15-24. I tumori sono stabiliti efficacemente da una breve esposizione della vescica di un piccolo volume di nitrato d'argento (5-10 microlitri, 0,15-1,0 M, ~ 10 sec) o contatto prolungato con poli-L-lisina (100 pl di 0,1 mg / ml per 20 min) (Tabella 1). Qui si descrive un metodo che utilizza tripsina per facilitare l'impianto di MB49 cellule.

Nel tentativo di migliorare gli approcci terapeutici per il cancro della vescica, la terapia genica ha raccolto notevole attenzione. Da un punto di vista clinico, cancro della vescica è un bersaglio ideale per la terapia genica a causa di facile accessibilità dell'organo e la capacità di fornire localmente il carico utile. Vettori virali che sono stati esplorati per la terapia genica del cancro della vescica includono una oncolytic virus herpes simplex ^{25, 26} retrovirus, virus del canarino ^27, virus vaccinico, AAV, e adenovirus ^28. Nella seconda parte del nostro protocollo, si descrive un metodo per la consegna virale che è praticamente identico a instillazione delle cellule tumorali. Di interesse nel nostro laboratorio è lo sviluppo di nuovi approcci alla consegna del gene, che valutiamo tramite bioluminescenza utilizzando un vettore adenovirale che esprime un transgene luciferasi. Tuttavia, la metodologia di cateterismo vescicale può essere utilizzato per la consegna di vari agenti e quindi ha vasta applicabilità.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati esaminati e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la Medical University of South Carolina. Il protocollo è stato approvato in base USDA categoria D per il dolore. 1. Impianto cellulare Due giorni prima di eseguire la procedura, piatto 1 x 10 6 MB49 cellule in T-25 palloni. Utilizzare alta DMEM glucosio supplementato con 10% FBS (e antibiotici, se lo si desidera). Una be…

Representative Results

Ematuria è osservato in quasi tutti i topi entro 8 giorni dopo l'impianto di 200.000 MB49 cellule. Come mostrato in Figura 1, peso vescica è più del doppio di 34,7 ± 3,3 mg (range 31-37 mg, n = 4) in topi non tumorali cuscinetto a 87,5 ± 19,2 mg (range 77-120 mg, n = 10) in topi che sono stati impiantati con MB49 cellule. In termini di consegna del gene, abbiamo trovato che l'imaging topi 24 ore dopo l'instillazione virale produce un segnale più forte dopo 48 ore (Figura 2).</s…

Discussion

La metodologia primario descritto in questo protocollo è cateterizzazione di vesciche topo, che ha applicazioni di massima per instillazione di cellule o di qualsiasi agente destinati per il recapito locale all'epitelio vescicale. Il protocollo specifica di cui sopra è stato ottimizzato per studi a breve termine (~ 10 giorni). Impiantare il numero esatto delle cellule è fondamentale, dal momento che un elevato numero di cellule si tradurrà in più rapida crescita del tumore e possibile perdita di animali a causa…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2