माउस स्पाइनल कॉर्ड में सशर्त हेरफेर जीन के लिए एक वायरल वेक्टर की Stereotaxic इंजेक्शन
Summary
वायरल वैक्टर लक्षित जीन हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं. हम सशर्त जीन की अभिव्यक्ति या माउस रीढ़ की हड्डी में पृथक के लिए एक विधि का प्रदर्शन, पृष्ठीय सींग में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन, प्राथमिक somatosensory afferents और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरॉन्स के बीच synaptic संपर्क का एक प्रमुख साइट का उपयोग कर.
Abstract
न्यूरॉन्स या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशेष क्षेत्रों के अलग आबादियों में एक वायरल वेक्टर Intraparenchymal इंजेक्शन सशर्त हेरफेर जीन में सक्षम बनाता है. हम एक stereotaxic इंजेक्शन तकनीक है कि लक्षित जीन या माउस रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग में अभिव्यक्ति मुंह बंद करने की अनुमति देता है को प्रदर्शित करता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया संक्षिप्त है. यह एक ही बांस की laminectomy, जानवर और रीढ़ की अछूता गतिशीलता के जल्दी ठीक होने के लिए उपलब्ध कराने की आवश्यकता है. कम और beveled कांच प्रवेशनी के साथ एक microsyringe की गति का उपयोग करने पर एक छोटे वेक्टर निलंबन मात्रा नियंत्रित इंजेक्शन ऊतक घाव को कम. स्थानीय वेक्टर के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नियोजित वायरस के आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है, हमारे अनुभव में, यह मामूली और अल्पकालिक है जब एक रीकॉम्बीनैंट एडिनो – जुड़े वायरस का प्रयोग किया जाता है. बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में इस तरह के एक पत्रकार जीन वेक्टर के स्थानिक वितरण निगरानी की सुविधा है, और प्रभावकारिता और सेलुलर speciअभिकर्मक के ficity.
Introduction
माउस में सशर्त जीन में गड़बड़ी की उन्नत प्रौद्योगिकियों synaptic केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में और रास्ते में कार्यात्मक कनेक्शन के अन्वेषण के लिए बहुमुखी दृष्टिकोण सक्षम. Transgenes डॉक्सीसाइक्लिन जैसे छोटे अणु effectors एक टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator, जो एक repressor या जीन प्रतिलेखन के एक उत्प्रेरक, या tamoxifen एक mutated एस्ट्रोजन एक रिसेप्टर ligand बाध्यकारी डोमेन को पहचानने के रूप में कार्य करने के लिए तैयार किया जा सकता है पर अभिनय द्वारा विनियमित किया जा सकता है . अपरिवर्तनीय transgene संशोधन आमतौर पर deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) recombinases द्वारा हासिल की है. (कारणों पुनर्संयोजन) Cre और FLP (flippase पुनर्संयोजन एंजाइम) छांटना उलटा, या डीएनए टुकड़े (पार x बिन्दुपथ के, P1) loxP या Frt (flippase मान्यता लक्ष्य) साइटों, 1 क्रमशः द्वारा flanked हैं स्थानान्तरण उत्प्रेरित. आवेदन जीन सक्रियण या मुंह बंद और inducible ribonucleic एसिड (आरएनए) हस्तक्षेप <sup> 2. Β-galactosidase या alkaline फॉस्फेट के रूप में या एंजाइमी फ्लोरोसेंट पत्रकारों की सशर्त अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स लेबल और उनके सामयिक संगठन और 3 कनेक्टिविटी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्तर (अमेरिका में बड़े पैमाने पर mutagenesis परियोजनाओं http://www.norcomm.org/index.htm ) और यूरोप ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) माउस भ्रूणीय स्टेम सेल क्लोनों के पुस्तकालयों के साथ उत्पादन कर रहे हैं सशर्त लक्ष्य जीन और जाल है कि अंततः पूरे माउस जीनोम को कवर किया जाएगा. इन क्लोन से उत्पन्न चूहे माउस लाइनों की संख्या एक विस्तार के साथ पार किया जा सकता है कि प्रमोटरों या loci चयनात्मक जीन हेरफेर के लिए न्यूरॉन्स की एक विशेष जनसंख्या (विशिष्ट तहत डीएनए recombinases व्यक्त http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index php. ).
<p class= "Jove_content"> हालांकि, न्यूरॉन्स या ब्याज की विशेष क्षेत्रों की आबादी के लिए अलग हेरफेर जीन सीमित आनुवंशिक अकेले लक्ष्यीकरण अगर एक हित के न्यूरॉन आबादी विशिष्ट प्रमोटर नहीं जाना जाता है या इस क्षेत्र में सभी न्यूरॉन्स द्वारा व्यक्त नहीं किया जा नहीं हासिल हो सकता है ब्याज की. रीढ़ की हड्डी में, प्रयोगात्मक डिजाइन एक या दो craniocaudal क्षेत्रों के लिए जीन में गड़बड़ी की स्थानिक प्रतिबंध की आवश्यकता हो सकती है. एक वायरल वेक्टर कि Cre या FLP व्यक्त करता Stereotaxic इंजेक्शन क्षेत्रों के लिए चूहों में जो डीएनए टुकड़े loxP या Frt साइटों द्वारा flanked हैं की रीढ़ की हड्डी में जीन पुनर्संयोजन सीमित floxed या flrted alleles तथाकथित की अनुमति देता है. विधान डीएनए पुनर्व्यवस्था के विपरीत, जो recombinase व्यक्त चूहों के साथ पशुओं crossbreeding से नतीजा होगा, इस रणनीति भी जीन सक्रियण या मुंह बंद करने पर अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है. वायरल वैक्टर एन्कोडिंग floxed या flirted transgenes चूहों में एक जीन में गड़बड़ी की रिवर्स विकल्प correspo व्यक्त की पेशकशन्यूरॉन विशेष के एक प्रमोटर के recombinase अनुप्रवाह nding. न्यूरॉन्स के लिए आत्मीयता के साथ कई रीकॉम्बीनैंट वैक्टर 4 उपलब्ध हैं. उच्च क्षमता (gutless) adenovirus, एडिनो – जुड़े वायरस, दाद सिंप्लेक्स वायरस और lentivirus सामान्यतः neurotropic वैक्टर किया जाता है. एक शोध प्रश्न के लिए उपयुक्त वायरस का चयन प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है. Transgene का आकार, प्रसव के मार्ग, संक्रमण के न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं, संक्रमण प्रभावकारिता, सूजन और जहरीले साइड इफेक्ट से 4 विचार करने की आवश्यकता के रूप में करने का विरोध करने के लिए विशिष्टता.यहाँ हम रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग, एक तकनीक है कि हम हमारे शोध में दर्द के तंत्रिका जीव विज्ञान पर सशर्त जीन विनियमन के लिए रोजगार में एक वायरल वेक्टर stereotaxic इंजेक्शन का वर्णन. पृष्ठीय सींग nociceptive न्यूरॉन्स सहित प्राथमिक somatosensory न्यूरॉन्स से अभिवाही इनपुट प्राप्त करता है. स्थानीय interneurons जानकारी प्रक्रिया से पहले प्रक्षेपण न्यूरॉन्स से संप्रेषित करने के लिए5 मस्तिष्क पृष्ठीय सींग. हम एक neurotropic पुनः संयोजक एडिनो – जुड़े वायरस (rAAV) कि एक constitutively सक्रिय cytomegalovirus प्रमोटर के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) व्यक्त के साथ रीढ़ की हड्डी में कमानी L4 स्तर पर पृष्ठीय सींग न्यूरॉन्स के संक्रमण को प्रदर्शित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
9,10 चोट, या जीन थेरेपी से उत्थान के दौरान या 11 neurodegeneration की रोकथाम और उपचार के लिए 6,7 या optogenetic 8 विच्छेदन, अक्षतंतु मार्गदर्शन में फैल transsynaptic वायरस पर आधारित Stereotaxic वेक्टर इंजेक्शन neuronal नेटवर्क मानचि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए ए Bakhos Tannous, पीएच.डी., वेक्टर और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, Charlestown, मैसाचुसेट्स, तंत्रिका विज्ञान केन्द्र में विकास और उत्पादन के हमें वेक्टर rAAV EGFP साथ प्रदान करने के लिए निदेशक, और जॉन मारना धन्यवाद. इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान से NS050408 R01 (जे एस).
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
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