Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord
Summary
Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.
Abstract
Intraparenchymale injectie van een virale vector kan afhankelijk genmanipulatie in verschillende populaties van neuronen of bepaalde delen van het centrale zenuwstelsel. We tonen een stereotactische injectie techniek gerichte genexpressie of silencing in de dorsale hoorn van het ruggenmerg kan muis. De chirurgische procedure is kort. Het vereist laminectomie van een enkele wervel, die voorziet in een snel herstel van het dier en ongeschonden beweeglijkheid van de wervelkolom. Gecontroleerde injectie van een kleine vector schorsing volume bij lage snelheid en het gebruik van een micro-met afgeschuinde glazen canule minimaliseren het weefsel laesie. De lokale immuunrespons op de vector hangt af van de intrinsieke eigenschappen van de gebruikte virus, in onze ervaring is klein en kort als een recombinant adeno-geassocieerd virus wordt gebruikt. Een reportergen zoals versterkt groen fluorescent eiwit vergemakkelijkt controle ruimtelijke verdeling van de vector en de werkzaamheid en cellulaire specificity van de transfectie.
Introduction
Geavanceerde technologieën voor voorwaardelijke genmanipulatie in de muis kan veelzijdige benaderingen van de exploratie van synaptische paden en functionele verbindingen in het centrale zenuwstelsel. Transgenen kan worden geregeld door kleine molecule effectoren zoals doxycycline die op een door tetracycline gecontroleerde transactivator, die kunnen worden ontworpen om als een repressor of activator van gentranscriptie, tamoxifen of herkennen van een gemuteerd ligand-bindend domein van de oestrogeen receptor 1 . Onomkeerbare transgene modificatie wordt meestal bereikt door desoxyribonucleïnezuur (DNA) recombinases. Cre (oorzaken recombinatie) en Flp (flippase recombinatie enzym) katalyseren de excisie, inversie of translocatie van DNA-fragmenten die worden geflankeerd door loxP (locus of kruising x over, P1) of Frt (flippase erkenning doel) sites, respectievelijk 1. Toepassingen omvatten genactivering of silencing en induceerbare ribonucleïnezuur (RNA) interferentie <sup> 2. Conditionele expressie van fluorescerende of enzymatische reporters zoals β-galactosidase of alkaline fosfatase kan worden gebruikt om neuronen labelen en onderzoek naar de actuele organisatie en verbinding 3. Grootschalige projecten mutagenese in Noord-Amerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) en Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produceren van bibliotheken van muis embryonale stamcellen klonen met conditionele gen doelen en valkuilen die uiteindelijk de gehele muis genoom. Muizen gegenereerd uit deze klonen kunnen worden gekruist met een toenemend aantal muizenlijnen die uitdrukken DNA recombinases onder promoters of loci specifiek voor een bepaalde populatie neuronen voor selectieve genmanipulatie ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> evenwel beperkt genmanipulatie tot afzonderlijke populaties van neuronen of bepaalde gebieden plaats niet worden bereikt door genetische richten alleen als een promotor specifiek voor de populatie neuron plaats niet bekend is of niet die door alle neuronen in de regio van belang. In het ruggenmerg kan experimenteel ontwerpen vereisen ruimtelijke beperking van de genetische manipulatie een of twee craniocaudale segmenten. Stereotactische injectie van een virale vector die Cre of Flp expressie kan beperken gen recombinatie regio in het ruggenmerg van muizen waarbij DNA-fragmenten worden geflankeerd door loxP of Frt sites, zogenaamde floxed of flrted allelen. In tegenstelling tot de constitutieve DNA herschikking, die zou voortvloeien uit kruisingen van de dieren met recombinase uitdrukken muizen, deze strategie biedt ook tijdelijke controle over gen-activatie of silencing. Virale vectoren die coderen floxed of flirtte transgenen bieden een omgekeerde optie van genetische manipulatie in muizen die het corresponding recombinase stroomafwaarts van een neuron-specifieke promoter. Verschillende recombinante vectoren met affiniteit voor neuronen zijn 4. Hoge capaciteit (laf) adenovirus, adeno-geassocieerd virus, herpes simplex virus en lentivirus worden gebruikt neurotrope vectoren. Het selecteren van de juiste virus voor een onderzoeks-vraag is een cruciaal onderdeel van de experimentele opzet. Grootte van het transgen levering route, specificiteit van de infectie neuronen in tegenstelling tot gliacellen, infectie efficiëntie, ontstekings-en toxische bijwerkingen moeten worden overwogen 4.Hier beschrijven we de stereotaxische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn van het ruggenmerg, een techniek die we gebruiken voor voorwaardelijke genregulatie in ons onderzoek naar de neurobiologie van pijn. De dorsale hoorn ontvangt afferente input van primaire somatosensorische neuronen inclusief nociceptieve neuronen. Lokale interneuronen verwerken de informatie voordat projectie neuronen het overbrengen vande dorsale hoorn naar de hersenen 5. We demonstreren de infectie van dorsale hoorn neuronen spinale segmentale niveau L4 met een neurotrope recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) die versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een constitutief actieve promoter cytomegalovirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotactische injectie vector kan gericht ruggenmerg neuronen voor toepassingen zoals neuronale netwerk mapping op basis transsynaptic virusverspreiding 6,7 of optogenetic dissectie 8, axon begeleiding tijdens regeneratie van letsel 9,10 of gentherapie voor de preventie of behandeling van neurodegeneratie 11, 12. Virale vectoren zijn gebruikt voor genetische manipulatie in het ruggenmerg te bestuderen somatosensorische, motorische en autonome wegen 9,10,13-15. De …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur van Vector Ontwikkeling en Productie in de Neuroscience Center van het Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, voor het verstrekken van ons met de rAAV-EGFP vector, en John Whang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies R01 NS050408 (naar JS) van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
