Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon
Summary
Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Bir viral vektörün intraparankimal enjeksiyon nöronlar ya da merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde farklı popülasyonlarda şartlı gen manipülasyonu sağlar. Biz fare omurilik dorsal boynuz hedeflenen gen ekspresyonu veya susturulması sağlayan bir stereotaksik enjeksiyon tekniği göstermek. Cerrahi prosedür kısa. Bu hayvan ve omurganın uğramamış motilite hızlı kurtarma sağlayan, tek vertebra laminektomi gerektirir. Eğimli cam kanül ile mikroenjektör düşük hız ve kullanım küçük bir vektör süspansiyon hacmi Kontrollü enjeksiyonu doku lezyonu aza indirmek. Vektör lokal bağışıklık cevabında istihdam virüs içsel özelliklerine bağlıdır; bizim deneyim, bir rekombinant adeno-ilişkili virüs kullanıldığında küçük ve kısa sürelidir. Bu tür gelişmiş yeşil floresan proteini gibi bir raportör gen vektör izlenmesi uzaysal dağılımının kolaylaştırır ve etkinliği ve hücresel specitransfeksiyon özgüllük.
Introduction
Fare koşullu gen manipülasyonu Gelişmiş teknolojiler merkezi sinir sisteminde sinaptik yollar ve fonksiyonel bağlantılarının araştırılması için çok yönlü yaklaşımlar sağlar. Transgenlerin östrojen reseptör 1 mutasyona uğramış bir ligand-bağlayıcı etki tanıyan bir repressör veya gen transkripsiyon aktivatörü veya tamoksifen gibi çalışması için dizayn edilebilir bir tetrasiklin kontrollü Transaktivatörü, hareket gibi doksisiklin gibi küçük moleküllü etkileyiciler tarafından düzenlenebilir . Tersinmez transgen değişiklik yaygın deoksiribonükleik asit (DNA) rekombinaz tarafından elde edilir. Cre (nedenleri rekombinasyon) ve FLP (flippase rekombinasyon enzim) eksizyonu, inversiyon veya sırasıyla 1 loxP (crossing x odağı üzerinde, P1) veya Frt (flippase tanınması hedef) siteleri tarafından kuşatılmıştır DNA parçalarının translokasyon katalize. Uygulamalar gen aktivasyonu veya susturulması ve indüklenebilir ribonükleik asit (RNA) girişime dahil <sup> 2. Bu tür β-galaktosidaz, alkalin fosfataz ya da enzimatik olarak floresan muhabir Koşullu ifade nöronlar etiket ve bunların topikal organizasyon ve bağlantı 3 incelemek için kullanılabilir. Kuzey Amerika (Büyük ölçekli mutajenez projeler http://www.norcomm.org/index.htm ) ve Avrupa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) ile fare embriyonik kök hücre klonlarının kütüphaneleri üretiyoruz sonunda tüm fare genomuna kapsayacak koşullu gen hedefleri ve tuzaklar. Bu klonlar elde Fare seçici gen manipülasyonu için nöronların belirli bir nüfus (özel yararlanıcılar veya lokus altında DNA rekombinaz ifade o fare hatları genişleyen bir sayı ile geçilebilir http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Ancak, nöronların veya ilgi belirli bölgelerde ayrı nüfus gen manipülasyonu kısıtlayan genetik ilgi nöron topluluğuna özgü bir organizatörü bilinir değilse yalnız hedefleme veya bölgedeki bütün nöronlar tarafından ifade değil elde edilemez ilgi. Spinal kord, deneysel tasarımlar bir veya iki kraniokaudal kesimlerine gen manipülasyonu mekansal kısıtlanması gerekebilir. Cre veya FLP ifade eden bir viral vektör Stereotaksik enjeksiyonu floxed veya flrted alel denilen, DNA parçalarının loxP veya Frt siteleri tarafından çevrili olduğu farelerde omurilik bölgelere gen rekombinasyon sınırlanmasını sağlayan. Bünye DNA düzenlenmesi aksine, hangi Rekombinaz ifade fare ile melezleme hayvanlardan neden olur, bu strateji aynı zamanda gen aktivasyonu veya susturulması üzerinde zamansal kontrol sağlar. Kodlama Viral vektörler floxed veya transgenlerin correspo ifade farelerde gen manipülasyonu bir ters seçeneği sunuyoruz flörtBir nöron spesifik promotör Rekombinaz aşağı nding. Nöronlara afinite ile Çeşitli rekombinant vektörler 4 mevcuttur. Yüksek kapasiteli (korkak) adenovirüs, adeno-ilişkili virüs, herpes simpleks virüsü ve lentivirüs yaygın nörotropik vektörler kullanılır. Bir araştırma sorusu için uygun olan virüs seçilmesi deneysel tasarım çok önemli bir parçasıdır. Transgen büyüklüğü, doğum şekli, inflamatuar ve toksik yan etkileri 4 düşünülmesi gereken glial hücreleri, enfeksiyon etkinliği, aksine nöronlara enfeksiyon özgüllüğü.Burada omurilik dorsal boynuz, biz ağrı nörobiyoloji üzerine araştırma koşullu gen regülasyonu için kullandıkları bir tekniktir bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon tarif. Dorsal boynuz nosiseptif nöronlar da dahil olmak üzere birincil somatosensoriyel nöronlardan gelen afferent girdi alır. Projeksiyon nöronları onu ifade etmeden önce yerel internöron bilgi işlembeyin 5 dorsal boynuz. Biz yapısal olarak aktif sitomegalovirüs organizatörü altında arttırılmıştır yeşil flüoresan protein (eGFP) ifade eden bir nörotropik rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) ile spinal segmental seviyede L4 dorsal boynuz nöron enfeksiyonu gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaksik vektör enjeksiyon, nörodejenerasyon 11 önlenmesi veya tedavisi için yaralanma 9,10, veya gen tedavisi rejenerasyon sırasında 6,7 veya optogenetic disseksiyon 8, akson kılavuz yayılan virüs transsinaptik dayalı bu tür nöronal ağ eşleme gibi uygulamalar için, omurilik nöronları hedefleme sağlar 12. Viral vektörler somatosensoriyel, motor ve otonomik yolların 9,10,13-15 çalışma omurilikte gen manipülasyonu içi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz teknik yardım için Bakhos A. Tannous, Ph.D., rAAV-eGFP vektör bize sağlamak için Massachusetts Genel Hastanesi, Charlestown, Massachusetts, Nörobilim Merkezi Vektör Geliştirme ve Üretim Direktörü, ve John Whang ederim. Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü ödenekle R01 NS050408 (JS için) desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
