Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Injection intra-parenchymateux d'un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d'injection stéréotaxique qui permet l'expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L'intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d'une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l'animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d'un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l'utilisation d'une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l'efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.
Introduction
Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l'exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène 1 . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
La procédure chirurgicale décrite a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) de l'Université de Columbia.
1. Préparation de l'équipement et de la suspension de particules de virus
- Nettoyer et désinfecter le matériel, stériliser les instruments chirurgicaux et les pointes entaille en V qui seront utilisés pour fixer L1 vertèbre.
- Tirez et pipettes en verre coniques. Nous utilisons des pipettes qui ont un diamètre de pointe de 40 um et sont biseautés à un angle de 20 °. Stériliser les pipettes en verre.
- Mettre en place le cadre stéréotaxique, monter l....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Rendements de transfection avec succès l'expression des gènes robuste neurones de la corne dorsale injecté (figure 1), épargnant la corne dorsale du côté controlatéral, la corne ventrale et les ganglions de la racine dorsale.
Figure 1. La transfection de neurones de la corne dorsale. (A) Expression de l'EGFP rapporteur fluorescent (vert) dans la corne gauche dorsale de la moelle .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d'étalement transsynaptique 6,7 ou 8 optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions 9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence 11, 12. Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la moelle épinière pour .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Remerciements
Nous remercions Bakhos A. Tannous, Ph.D., directeur du développement et de la production Vector dans la Neuroscience Center du Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, pour nous avoir fourni le vecteur rAAV-EGFP, et John Whang pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par une bourse R01 NS050408 (JS) de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du produit | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| Plaque de base épinière | David Kopf Instruments | 912 | |
| Petit instrument stéréotaxique animaux | David Kopf Instruments | 900 | |
| Gaz souris de tête anesthésie titulaire | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Supports de base ajustables | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch pointes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Petit système de contrôle de la température des animaux | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson pince | Outils Fine Science | 11006-12 | |
| Pince laminectomie | Outils Fine Science | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (un) par SYS-MICRO4 contrôleur | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microseringue 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| Raccord à compression RN, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Verre borosilicate capillaires | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
Références
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
