Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse
Summary
Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.
Abstract
Iniezione intraparenchimale di un vettore virale consente la manipolazione condizionale gene in distinte popolazioni di neuroni o regioni specifiche del sistema nervoso centrale. Dimostriamo una tecnica stereotassica iniezione che permette l'espressione del gene bersaglio o silenziamento nel corno dorsale del midollo spinale del mouse. La procedura chirurgica è breve. Richiede laminectomia di una singola vertebra, che prevede il recupero rapido dell'animale e motilità perfetta della colonna vertebrale. Iniezione controllata di un piccolo volume di sospensione vettore a bassa velocità e l'uso di una cannula microsiringa con vetro smussato minimizzare la lesione tissutale. La risposta immunitaria locale al vettore dipende dalle proprietà intrinseche del virus impiegati, nella nostra esperienza, è minore e di breve durata, quando un ricombinante adeno-associated virus viene utilizzato. Un gene reporter come migliore proteina fluorescente verde facilita distribuzione spaziale monitoraggio del vettore, e l'efficacia e cellulare specificity della trasfezione.
Introduction
Le tecnologie avanzate di manipolazione genica condizionale nel topo consentono molteplici approcci per l'esplorazione di sinapsi e collegamenti funzionali del sistema nervoso centrale. Transgeni può essere regolata da piccole molecole come effettori doxiciclina agenti su un transattivatore della tetraciclina controllato, che può essere progettato per funzionare come un repressore o un attivatore della trascrizione genica, o tamoxifene riconoscere un mutato ligando dominio di legame del recettore di estrogeno 1 . Modifica irreversibile transgene è comunemente ottenuto da acido desossiribonucleico (DNA) ricombinasi. Cre (ricombinazione cause) e Flp (enzima ricombinazione flippase) catalizzare l', inversione escissione o la traslocazione di frammenti di DNA che vengono affiancati da loxP (luogo di x crossing over, P1) o Frt (target riconoscimento flippase) siti, rispettivamente, 1. Le applicazioni includono l'attivazione del gene o silenziamento inducibile e acido ribonucleico (RNA) ingerenza <sup> 2. Espressione condizionale reporter fluorescente o enzimatica come β-galattosidasi o fosfatasi alcalina può essere usato per etichettare neuroni ed esaminare la loro organizzazione topica e connettività 3. Grandi progetti di mutagenesi in Nord America ( http://www.norcomm.org/index.htm ) e in Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) producono librerie di cloni di cellule staminali embrionali di topo con obiettivi gene condizionali e le trappole che alla fine coprono l'intero genoma del mouse. Topi generati da questi cloni possono essere attraversata con un numero crescente di topi che esprimono ricombinasi DNA sotto promotori o loci specifici per una particolare popolazione di neuroni di manipolazione genica selettiva ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Tuttavia, limitando la manipolazione genetica di popolazioni distinte di neuroni o regioni particolari di interesse non può essere ottenuto genetica mira solo se un promotore specifico per la popolazione neurone di interesse non è noto o non espresso da tutti i neuroni della regione di interesse. Nel midollo spinale, disegni sperimentali possono richiedere restrizione spaziale della manipolazione genetica di uno o due segmenti cranio-caudale. Iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime Cre o Flp consente di limitare ricombinazione genica per regioni nel midollo spinale di topi in cui si affiancano frammenti di DNA da loxP o siti FRT, cosiddetti alleli floxed o flrted. A differenza di riarrangiamenti del DNA costitutivo, con la conseguenza di incroci animali con topi che esprimono ricombinasi, questa strategia consente anche il controllo temporale su attivazione genica o silenziamento. Vettori virali codificanti floxed o flirtato transgeni offre un'opzione di inversione di manipolazione del gene nei topi esprimere la corresponding valle ricombinasi di un neurone-specifica promotore. Diversi vettori ricombinanti con affinità per i neuroni sono disponibili 4. Alta capacità (gutless) adenovirus, virus adeno-associati, virus dell'herpes simplex e lentivirus sono comunemente utilizzati vettori neurotropici. Selezione del virus appropriato per una domanda di ricerca è una parte cruciale del disegno sperimentale. Dimensione del transgene, percorso di consegna, specificità dell'infezione di neuroni a differenza di cellule gliali, efficacia infezione, effetti collaterali tossici infiammatori e devono essere considerati 4.Qui descriviamo l'iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale del midollo spinale, una tecnica che usiamo per la regolazione genica condizionale nella nostra ricerca sulla neurobiologia del dolore. Il corno dorsale riceve l'input afferente da primari neuroni somatosensoriali inclusi i neuroni nocicettivi. Interneuroni locali elaborare le informazioni prima di neuroni di proiezione che trasmettono dail corno dorsale al cervello 5. Dimostriamo l'infezione di neuroni del corno dorsale a livello segmentale spinale L4 con neurotropico ricombinante virus adeno-associato (rAAV) che esprime migliorato proteina fluorescente verde (EGFP) sotto un promotore di citomegalovirus costitutivamente attivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iniezione stereotassica vettore permette il targeting neuroni del midollo spinale per applicazioni come la mappatura della rete neuronale basata sul virus transsynaptic diffondere 6,7 o dissezione optogenetic 8, la guida durante la rigenerazione assonale da lesioni 9,10, o la terapia genica per la prevenzione o il trattamento di neurodegenerazione 11, 12. Vettori virali sono stati utilizzati per la manipolazione del gene nel midollo spinale di studiare somatosensoriali, motori…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direttore dello Sviluppo e Produzione vettore nel Centro Neuroscienze del Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, per averci fornito il rAAV-EGFP vettore, e John Whang per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01 NS050408 (JS), presso l'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
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