마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입
Summary
바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
바이러스 벡터의 Intraparenchymal 주사가 뉴런 또는 중추 신경계의 특정 지역의 독특한 인구에 조건부 유전자 조작을 할 수 있습니다. 우리는 마우스 척추의 등 뿔의 대상으로 유전자 발현이나 입을 수 stereotaxic 분사 기술을 보여줍니다. 수술 절차는 간단합니다. 그것은 동물과 척추 손상되지 않은 운동성의 빠른 복구를 위해 제공하는 하나의 척추 뼈의 laminectomy이 필요합니다. beveled 유리 캐뉼라와 microsyringe의 낮은 속도와 사용의 작은 벡터 정지 볼륨의 조절 주입은 조직 병변을 최소화합니다. 벡터에 대한 현지 면역 반응은 고용 바이러스의 고유 특성에 따라, 우리의 경험으로는, 재조합 adeno – 관련 바이러스가 사용될 때 미성년자 수명이 짧은 것입니다. 이러한 강화 된 녹색 형광 단백질 등의 리포터 유전자는 벡터의 모니터링 공간 배포를 용이하게하고, 효능 및 세포 specitransfection의 ficity.
Introduction
마우스 조건부 유전자 조작의 고급 기술은 중추 신경계의 신경 경로와 기능 연결의 탐구에 다각적 인 접근을 가능하게합니다. Transgenes은 에스트로겐 수용체 (1)의 변이 리간드 결합 도메인을 인식 억제 또는 유전자 전사의 활성화, 또는 tamoxifen으로 작동하도록 설계 할 수있는 테트라 사이클린 제어 transactivator에 행동 등 doxycycline와 같은 작은 분자 effectors에 의해 규제 될 수 있습니다 . 돌이킬 수없는 transgene 수정은 일반적으로 데 옥시 리보 핵산 (DNA) recombinases에 의해 달성된다. Cre (원인 재조합) 및 Flp (flippase 재조합 효소)는 절단, 반전 또는 각각 1 loxP (교차로 X의 궤적 이상, P1) 또는 Frt (flippase 인식 대상) 사이트로 둘러싸인 아르 DNA 조각의 translocation을 catalyze. 응용 프로그램은 유전자 활성화 또는 입을과 inducible ribonucleic 산성 (RNA) 간섭을 포함 <sup> 2. 이러한 β-갈 락토 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 형광 또는 효소 기자 조건부 표현식은 뉴런에 라벨 및 국소 조직과 연결 심사 3하는 데 사용할 수 있습니다. 북미 (의 대규모 mutagenesis 프로젝트 http://www.norcomm.org/index.htm )와 유럽 ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm가 )와 마우스 배아 줄기 세포 클론의 라이브러리를 생산하고 있습니다 결국 전체 마우스 게놈을 충당 할 조건부 유전자 목표 및 트랩. 이 클론에서 생성 된 쥐들이 선택적 유전자 조작에 대한 뉴런의 특정 인구 (에 특정 발기인 또는 loci에서 DNA의 recombinases을 표현하는 마우스 라인의 확장 번호로 교차 될 수 있습니다 http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP ).
<p class= "jove_content"> 그러나, 뉴런 또는 관심 분야의 특정 지역의 고유 한 사람들에게 유전자 조작을 제한하는 것은 유전자 관심의 신경 세포 인구에 특정 발기인이 알려져 있지 않은 경우 혼자 타겟팅 또는 지역의 모든 뉴런으로 표현하지함으로써 달성 할 수 없습니다 관심. 척수에서 실험 디자인은 하나 또는 두 개의 craniocaudal 세그먼트에 유전자 조작의 공간적 제한을 요구할 수 있습니다. Cre 또는 Flp을 표현 바이러스 벡터의 Stereotaxic 주입 floxed 또는 flrted 대립 유전자 소위, DNA 조각이 loxP 또는 Frt 사이트으로 둘러싸인되어있는 마우스의 척수에 지역에 유전자 재조합을 제한 할 수 있습니다. 제정 DNA를 다시 정리하기는 달리, 이는 recombinase 표현 생쥐와 이종 교배하는 동물에서 나타날 전략이 또한 유전자 활성화 또는 입을 통해 일시적으로 제어 할 수 있습니다. 인코딩 바이러스 성 벡터는 floxed 또는 transgenes이 correspo을 표현하는 쥐 유전자 조작의 역 옵션을 제공 경솔한 짓을뉴런 특정 발기인의 recombinase의 하류를 nding. 뉴런에 대한 친화력과 여러 재조합 벡터는 4 이용하실 수 있습니다. 높은 용량 (베짱) 아데노 바이러스, adeno – 관련 바이러스, 헤르페스는 바이러스를 단순하고 lentivirus는 일반적으로 neurotropic 벡터를 사용합니다. 연구 질문에 해당하는 바이러스를 선택하면 실험 설계의 중요한 부분입니다. transgene의 크기, 배달 경로, 염증과 독성 부작용 4 간주해야 glial 세포, 감염 효능, 반대로 뉴런에 감염의 특이성.여기 우리는 척추의 등 뿔, 우리는 고통의 신경 생물학에 대한 우리의 연구에서 조건부 유전자 조절을위한 고용 한 기술로 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 설명합니다. 등쪽 뿔은 nociceptive 뉴런을 포함한 기본 somatosensory 뉴런에서 수입 성의를 입력받습니다. 프로젝션 뉴런이에서 전달하기 전에 지역 interneurons는 정보를 처리뇌 5 등쪽 뿔. 우리는 constitutively 활성화 사이토 메갈로 바이러스 프로모터에서 더욱 녹색 형광 단백질 (eGfp)를 표현하는 neurotropic 재조합 adeno – 관련 바이러스 (rAAV)와 척추 segmental 수준 L4의 등쪽 뿔 뉴런의 감염을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaxic 벡터 주입은 neurodegeneration 11 예방 또는 치료에 대한 상해 9,10, 또는 유전자 치료에서 재생하는 동안 6,7 또는 optogenetic의 해부 8, 축삭 안내를 확산 transsynaptic 바이러스에 따라 이러한 neuronal 네트워크 매핑과 같은 응용 프로그램에 대한 척추의 뉴런을 대상으로 할 수 있습니다 12. 바이러스 벡터는 somatosensory, 모터 및 자율 경로주세요 9,10…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 Bakhos A. Tannous, 박사, rAAV-eGfp 벡터으로 우리를 제공 매사추세츠 종합 병원, 찰스 타운, 매사추세츠,의 신경 과학 센터에서 벡터 개발 및 생산 이사, 존 강타 감사드립니다. 이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 교부금으로 R01 NS050408을 (JS까지) 지원되었습니다.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
