Summary
توضح هذه الدراسة تقنية فعالة لعزل ومعالجة أنسجة اللثة من تجويف الفم الماوس من أجل إنتاج ثقافة وحيدة الخلية. الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كذلك لتحليل التدفق الخلوي والدراسات الجزيئية.
Abstract
لقد قمنا بتطوير تقنية لعزل بدقة ومعالجة الأنسجة اللثوية الفئران لالتدفق الخلوي والدراسات الجزيئية. اللثة هي النسيج فريدة وهامة لدراسة آليات المناعة لأنها تشارك في الاستجابة المناعية المضيف ضد بيوفيلم عن طريق الفم التي قد تسبب أمراض اللثة. وعلاوة على ذلك، وعلى مقربة من اللثة إلى أنسجة العظم السنخي تمكن تدرس أيضا إعادة تشكيل العظام في ظل ظروف التهابات. لدينا وسيلة تعطي كمية كبيرة من الخلايا المناعية التي تتيح تحليل حتى السكان الخلية نادرة مثل خلايا لانغرهانس وخلايا T التنظيمية كما أثبتنا سابقا 1. الفئران التي تستخدم لدراسة الاستجابات المناعية المحلية المعنية في فقدان العظم السنخي خلال أمراض اللثة هو مفيد بسبب توافر مختلف الأدوات المناعية والتجريبية. ومع ذلك، نظرا لصغر حجم وغير مريح نسبيا الوصول إلى اللثة الفئران، تجنب العديد من الدراسات دراسة ثيق الحرجة في الأنسجة. الطريقة الموضحة في هذا العمل يمكن أن تسهل تحليل اللثة، التي نأمل زيادة التفاهم لدينا على الجهاز المناعي عن طريق الفم ودورها خلال أمراض اللثة.
Introduction
اللثة هي الأنسجة الرخوة المحيطة عنق الرحم جزء من الأسنان ويغطي عملية السنخية (الشكل 1). اللثة هو نوع من الغشاء المخاطي المضغ التي يمكن تقسيمها إلى مزيد من ظهارة الغشاء المخاطي والنسيج الضام (المعروف أيضا باسم مخاطية أو الصفيحة المخصوصة). بنية التشريحية للاللثة والأسنان المجاورة يسمح البكتيريا للإقامة وتطوير لوحة (بيوفيلم) التي تتحدى باستمرار الجهاز المناعي المحلية. ونتيجة لذلك، يطور الاستجابة الالتهابية في اللثة، والتي في ظروف معينة يصبح المدمرة - وهي حالة تسمى أمراض اللثة 2. في الأساس، ويمكن تقسيم أمراض اللثة البلاك التي يسببها التهاب اللثة والتهاب اللثة إلى. التهاب اللثة يمثل حالة عكسها من الاستجابة الالتهابية المحلية أن يقتصر على اللثة. التهاب اللثة، من ناحية أخرى، هو عملية تدميرية لا رجعة فيه جهاز مرفق (العظم السنخي، اللثةيتم تدمير الرباط، الملاط واللثة) 3.
واقترح اللثة لخدمة المواقع على حد سواء المستجيب كما وحثي خلال أمراض اللثة 4. وقد اقترحت الدراسات أن الإنسان استجابة لوحة الأسنان، وخلايا المستجيب المناعي والجزيئات تسللت بشكل حيوي أو مغادرة اللثة 5-7. وقد تبين هذا النشاط لتلعب دورا رئيسيا في تدمير اللثة 8،9. في حين البيانات التي تولدها هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة بخصوص هذه العملية المرضية، والعمل مع الأنسجة البشرية تمتلك القيود الأخلاقية والتقنية والتجريبية الكبرى. تطوير نماذج تجريبية يسمح التجريب السبب والنتيجة عبر استخدام الفئران المعدلة وراثيا والتدخلات في الجسم الحي 10. ونتيجة لذلك، علمنا على الآليات التي تشارك في أمراض اللثة زيادة كبيرة خلال العقدين الماضيين. وحتى مع ذلك، ونظرا لتعقيد أمراض اللثة، وهناكمناقشة جارية بشأن طبيعة الاستجابة المناعية المحلية تسهيل تدمير الأنسجة. هناك أيضا نقص في فهمنا على وظيفة الخلايا المناعية المركزية في اللثة أثناء أمراض اللثة. وبالتالي فمن الضروري دراسة الأحداث التهابات المرضية التي تحدث في النسيج المستهدف لهذا المرض، واللثة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إعداد مقدما:
- PBS + 2٪ FCS
- PBS + 2٪ FCS مع 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز النوع الأول (1 مل لكل عينة)
- تعقيم الأدوات الجراحية
- 0.5 M الحل EDTA
1. العلوي وتقنيات استئصال اللثة
- الموت ببطء الفئران باستخدام التوجيه IACUC المعتمدة.
- قطع جانبي تجويف الفم بما في ذلك الخدين والفك السفلي مع الفرع حاد / كليل مقص على التوالي.
- هدم الفك السفلي.
- قطع الأنسجة الرخوة والصلبة في وهمي خط 1 ملم وراء الأضراس ثلثي مع مقص القياسية. توجيه مقص عمودي على الطائرة من العظم الحنكي (الشكل 2A، خطوط زرقاء).
- شق الأنسجة الصلبة واللينة 2 ملم وراء القواطع (الشكل 2A، خطوط زرقاء).
- هدم الجزء الأمامي من الفم. يتم ملاحظتها تجويف الأنف بعد هذه الخطوة.
- ضع مقصبالتوازي مع الحنك، وضعت شفرة واحدة في تجويف الأنف، ينبغي أن نصل غيرها من شق في الدهليز. قطع حتى شق الخلفي (الشكل 2A، خطوط خضراء). كرر هذه الخطوة على جانبي الفك العلوي. في النهاية هو فصل الفك العلوي عن بقية الجمجمة (الشكل 2B).
- إزالة الفك العلوي، قطع عليه في خياطة الأوسط (الشكل 2، أسود خط متقطع) وتقليم الأنسجة حنكي من كل نصفي الفك العلوي حتى تصل إلى العظم السنخي.
- قشر أنسجة اللثة (كلا نصفي للفك العلوي) من حدودهما الأمامي مع أدسون ملقط (بدون أسنان).
- وضع اللثة رفعه في لوحة مع PBS + 2٪ FCS.
2. اللثة التحميل
- وضع اللثة رفعه في طبق زراعة الأنسجة (35 × 10 مم) مع 1 مل PBS + 2٪ FCS، 2 ملغ / مل من كولاجيناز من النوع الثاني و 1 ملغ / مل من الدناز نوع I.
- اللحم المفروم جيدا الأنسجة مع N ° 15 شفرة جراحية معقمة.
- TRansfer الأنسجة من لوحة إلى 15 مل أنبوب اختبار المخروطية.
- غسل خلايا الأنسجة / المتبقية على لوحة مع 1 مل PBS + 2٪ FCS ونقل إلى أنبوب اختبار نفسه.
- احتضان في حاضنة شاكر لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة (التوصية: سخن الحاضنة).
- إضافة 20 ميكرولتر من EDTA 0.5 M واحتضان لمدة 10 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة.
- ملء أنبوب اختبار ما يصل إلى 12 مل مع برنامج تلفزيوني + 2٪ FCS وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 400 x ج لمدة 8 دقائق (التوصية: مرحلة ما قبل البرد أجهزة الطرد المركزي).
- إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 2 مل PBS + 2٪ FCS.
- تحديد عينة مع 70 ميكرومتر الخلية مصفاة وحفظ تدفق من خلال.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا طاف و resuspend مع 300 ميكرولتر PBS + 2٪ FCS.
- عد الخلايا (ومن المتوقع حوالي 5-10 × 10 5 خلايا من الفك العلوي واحد).
3. جسم الخلية وبين الخلاياتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي
فمن المستحسن للعمل داخل غطاء محرك السيارة، مع الأنوار. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الخلايا في بيئة باردة مستمر، وكذلك جميع المواد اللازمة.
- وصمة عار الخلايا ضد الجزيئات خارج الخلية عن طريق إضافة 0.2-0.5 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر.
- لفترة وجيزة الدوامة.
- احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مع 2 مل PBS + 2٪ FCS.
- أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 320 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح الخلايا طاف و resuspend بإضافة قطرة من الحكمة، و 500 ميكرولتر BD الباردة Cytoperm / Cytofix بينما vortexing ل.
- احتضان الأنابيب لمدة 40 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- لفترة وجيزة الدوامة.
- غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف باستثناء 300 ميكرولتر.
- وصمة عار الخلايا داخل الخلية بواسطةإضافة 1 ميكروغرام من كل الأجسام المضادة المحددة في 1 × 10 6 خلايا في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر.
- لفترة وجيزة الدوامة.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مرتين مع 1 مل بيرم BD الباردة / غسل العازلة وتدور في 800 x ج لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نضح الخلايا طاف و resuspend عن طريق إضافة 300 ميكرولتر بيرم / غسل BD الباردة العازلة.
- لفترة وجيزة الدوامة.
- نقل تعليق بينما تصفية لأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إبقاء الأنابيب في بيئة مظلمة وباردة حتى التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض أمثلة على تحليل التدفق الخلوي في خلايا اللثة. تم تشغيل خلايا اللثة المجمعة من 2 فئران في LSR الثاني تدفق عداد الكريات وتحليلها باستخدام FlowJo البرمجيات. أثبتت الشكل 3A توزيع خلايا اللثة من الفئران السذاجة في الجانب مبعثر (SSC) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة. استراتيجية المحاصرة لتحديد (ط) الخلايا الليمفاوية (II) حيدات / الخلايا الجذعية و (الثالث) ويشار المحببة. لغرض المقارنة، فإننا نقدم أيضا مؤامرة FACS توضح خلايا اللثة تنقيته من P. اللثوية إصابة الفئران بعد 21 يوما أنبوب تغذية عن طريق الفم في وضع اللثة التجريبية ونحن سبق وصفها (الشكل 3B). زيادة في مختلف السكان الخلايا المناعية يمكن اكتشافه بسهولة في الفئران المصابة بالمقارنة مع الفئران السذاجة. المقبل، ونحن تحديد الخلايا المناعية في اللثة التي تتم معالجتها بواسطة تبوب على الخلايا المكونة للدم معربا عن علامة CD45 (الشكل 4A). T مزيد من فصل الخلايا ذات المناظر في خلايا إيجابية CD3 تمثل خلايا T (الشكل 4B). كما حددنا العدلات اللثة وفقا لتعبير عن Ly6G والجزيئات CD11b (الشكل 4C). وأخيرا، تم تحديد خلايا لانغرهانس، مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية الظهارية (DCS)، بواسطة تبوب على MHC من الدرجة الثانية + + CD11c والخلايا (علامة من DCS الفئران) والتعبير عن EP-CAM وlangerin/CD207 (تلطيخ الخلايا) (الشكل 4D).
الشكل 1. رسم تخطيطي يبين المعالم التشريحية للاللثة.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
الشكل 2. تخطيطيا من تجويف الفم الماوس الناتج بعد إكمال الخطوة 1.3 الأنسجة الرخوة من الخلف إلى الأمام:. الماضغة العضلات (MM)، والحنك الرخو (SP) والحنك الصلب (HP)، اللثة (G). الأنسجة الصلبة: الأضراس والقواطع. والهدف الرئيسي من هذه التقنية هو عزل الأنسجة اللثوية التي تحيط الأضراس ثلاثة (داخل البيضاوي الأسود).
الشكل (3). تم تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية ممثل المؤامرات يتظاهرون توزيع الخلوية من الكريات البيض اللثة. عينات اللثة معالجتها على LSR الثاني تدفق عداد الكريات وتحليلها باستخدام FlowJo البرمجيات. الجانب مبعثر (SSC) مقابل مبعثر إلى الأمام (FSC) قطع من الخلايا اللثة من (A) الفئران السذاجة أو (B) اللثة الملتهبة هي بريهented. موقع (ط) الخلايا الليمفاوية (II) حيدات / الخلايا الجذعية و (الثالث) ويشار المحببة السكان.
الشكل 4. ممثل FACS المؤامرات يدل تحليل خلايا اللثة المناعي. (A) تم تحديد الخلايا المناعية وفقا لCD45 التعبير. بعد تبوب على خلايا CD45 الإيجابية والخلايا الليمفاوية السكان والتعبير عن CD3 مكن استهداف تي خلية فرعية. (B) تم تحديد العدلات في اللثة وفقا لقدرة الخلايا + CD45 للتعبير أيضا Ly6G وCD11b. (C) وكانت الخلايا الجذعية التي حددها تبوب على خلايا CD45 + من السكان الوحيدات / شجيري [الشكل 3، بوابة (II)]، ومن ثم على MHC من الدرجة الثانية والخلايا CD11c إيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفك العلوي أنسجة اللثة الحصول عليها من ماوس واحدة كافية لتحليل المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا الليمفاوية T و B، وكذلك قدرتها على التعبير عن جزيئات الخلية وبين الخلايا كما وصفنا سابقا 1. ومع ذلك، إذا السكان الخلية نادرة ذات أهمية (على سبيل المثال ن)، فمن المستحسن أن الأنسجة تجمع 2-3 الفئران. من ملاحظة، إذا الأفضل، وأنه من الممكن أن قشر كل من أنسجة الحنك واللثة ومن ثم إلى استئصال اللثة (أ تعديل الخطوة 1،8-1،9). تجدر الإشارة أيضا إلى أن الفك السفلي اللثة يمكن جمعها كذلك؛ يزال، عزلتها أكثر تعقيدا ويمكن أن تشمل الأنسجة الأخرى التي قد تتداخل مع التحليل.
التقنيات الشائعة لدراسة الخلايا المناعية في اللثة هي المناعية والمناعي. هذه التقنيات تمكين التصور من توزيع هدفا جزيء / الخلية من خلال اللثة، وفحص العديد من الميدانمطلوب و من أجل دراسة منطقة معينة. في حين أن التعريب الفسيولوجية للخلايا معينة لا يمكن تحديده من خلال التدفق الخلوي بسبب معالجة اللثة، فإن هذا النهج يوفر العديد من المزايا الأخرى: (1) التدفق الخلوي هو طريقة سريعة وبسيطة لتحليل أعداد كبيرة من الخلايا (2) أنه يقلل الأخطاء تحليل تنشأ من تجانس الأنسجة (3) أنه تمكن من تحليل للسكان الخلية النادرة (4) لأنها تتيح تحليل مختلف المتغيرات في وقت واحد (5) لأنها تتيح التمييز بين الخلايا الحية والميتة (6) ويسمح تحليل وظيفي للخلايا الناتجة عن ذلك.
القدرة على إجراء تحليل التدفق الخلوي على أنسجة اللثة أثناء أمراض اللثة التجريبية يعزز من قدرتنا على الكشف عن الآليات المناعية تشارك في هذه العملية. دراسة طولية من التغيرات الخلوية التي تحدث في ما يلي التعرض لمسببات الأمراض اللثة عن طريق الفم يجب توفير المزيد من المعلومات ذات الصلة بدلا من قياس الاستجابات المناعية لياليystemically. هذا الجانب له أهمية خاصة عند تحليل النمط الظاهري وحركية من خلايا التهابية الفطرية والتكيفية في اللثة الملتهبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل (رقم 1418/11) لآه و(رقم 1933-1912) إلى AW، ومؤسسة الإسرائيلية الألمانية للمحققين الشباب (GIF يونغ) إلى الخبر، وأنا د. . صندوق الهبات للبحوث Cabakoff في مدرسة الجامعة العبرية هداسا طب الأسنان لآه وAW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
